大肠杆菌感受态细胞培训课件.ppt
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- 大肠杆菌 感受态 细胞 培训 课件
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1、大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞1.实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。生物学研究中的意义。大肠杆菌感受态细胞22.相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法(如:受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的等化学试剂法)的处理
2、后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源通透性发生变化,成为能容许多有外源D N A 的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞(competent cell)。大肠杆菌感受态细胞3转化(转化(transformation):是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体
3、细胞出现新的遗传性遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。甲基化酶的突变株。大肠杆菌感受态细胞4转化的方法:转化的方法:1.化学的方法化学的方法(热击法热击法);使用化学试剂(如使用化学试剂(如CaCl)制备的感受态细胞,通过热击处制备的感受态细胞,通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞;分子导入受体细胞;2.电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将
4、载体感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。大肠杆菌感受态细胞5将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养,才能较容易地筛选出转化体,基中培养,才能较容易地筛选出转化体,即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞。否则,分子的受体细胞。否则,如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上,会出现成千上万的细菌的培养基平板上,会出现成千上万的细菌菌落,将难以确认哪一个克隆含有转化的菌落,将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细质粒。虽然只有那些含有被转化质粒
5、的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖,菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖,但对于连接混合物而言,此时并不能确定但对于连接混合物而言,此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。哪个克隆含有插入片段。大肠杆菌感受态细胞7重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、进行酶切分析、插入失活、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶进行酶切分析,对于带有切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以基因的载
6、体还可以结合结合-互补现象来筛选。互补现象来筛选。大肠杆菌感受态细胞8-互补现象:互补现象:因为有些载体都带有一个因为有些载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序基因的调控序列和头列和头146146个氨基酸的编码信息,编码个氨基酸的编码信息,编码-互补互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖半乳糖苷酶实现基因内互补(苷酶实现基因内互补(-互补互补)。)。当这种载当这种载体转入可编码体转入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序列的端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基宿主细胞中时,在异丙基-D-D硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷(IPTGIPTG)的诱导下,)的诱导下
7、,宿主可同时合成这两种宿主可同时合成这两种肽段,肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为以称这种现象为-互补现象。互补现象。大肠杆菌感受态细胞9由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶(LacLacZ)Z)能够作能够作用于生色底物用于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而产生蓝色的菌落,所而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当
8、插入一个之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源外源DNADNA片段时,会造成片段时,会造成LacLacZ(Z()基因的失活,基因的失活,破坏破坏-互补作用,互补作用,就不能产生具有活性的酶。就不能产生具有活性的酶。所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色。组质粒的菌落为蓝色。大肠杆菌感受态细胞10大肠杆菌感受态细胞11重组重组DNADNA转化细菌过转化细菌过程示意图程示意图大肠杆菌感受态细胞123仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无菌超净台,电热恒温水浴,分光光度计,离心无菌超净台,电热恒温水浴,分光光度计,离心机,移液器,微型离心管等;
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