大肠埃希氏菌计数-产气课件.ppt

1、大肠杆菌的定义广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在发酵乳糖产酸产气、生化试验(靛基质、甲基红、试验、柠檬酸盐)为 或 的革兰阴性杆菌。2卫生学意义大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，是指示粪便污染最理想的指标，应用也最悠久。自年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了多年。为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂。3随着食品卫生标准的日益科学和细化，以与对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多。可作为评价消毒效果的指示菌。4大肠杆菌的生化特性形态与染色：革兰染

2、色朱阴性无芽胞的短小杆菌；多数菌株有根鞭毛，能运动。少数菌有荚膜。培养特性：需氧或兼性厌氧。最适温度，但在也能生长。最适。5 大肠埃希氏菌计数 “大肠杆菌平板计数”改为“大肠埃希氏菌平板计数法”删除大肠杆菌测试片计数法6大肠杆菌计数第一法：法第二法：大肠埃希氏菌平板计数法7第一法 大肠杆菌计数法8大肠杆菌计数法检验程序9样品的稀释固体和半固体食品：称取样品，放入盛有 生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，于 均质，或放入盛有 生理盐水的无菌均质袋中，用均质器拍打，制成的样品匀液。样品匀液的值应在之间，必要时分别用氢氧化钠或盐酸调节。10用无菌吸管或微量移液器吸取：样品匀液，沿管壁徐徐注盛有磷酸

3、盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触与稀释液面)，振摇试管或换用一支无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成：的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释次，换用支无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至接种完毕，全过程不得超过。11初发酵试验选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种管肉汤，每管接种（如接种量需要超过，则用双料肉汤），培养，观察小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至。记录在内产气的管数。如所有肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌结果；如有产气者，则进行复发酵试验。12复发酵试验用接种环分别从所

4、有内发酵产气的管取培养物环，移种到已提前预温至的肉汤管中，放入带盖的水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养，检查小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至。记录在和内产气的肉汤管数。如所有肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌结果。如有产气者，则进行平板分离培养。13伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分离于伊红美蓝（）平板。培养后，检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。14营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑选个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，培养，取培养物进行革兰染色和生化试验。15生化试验靛基

5、质试验：将培养物接种于蛋白胨水，培养，加靛基质试剂，上层出现红色为阳性。试验：将培养物接种于培养基，培养，移取培养物至小试管中，加萘酚乙醇溶液、氢氧化钾和少许肌酸结晶。振摇后静置，如出现伊红色为试验阳性。16将试验剩余培养物再培养后，滴加滴甲基红试剂，培养物变红为甲基红试验阳性；变黄为阴性。柠檬酸盐利用试验：将培养物接种于氏柠檬酸盐肉汤，培养，记录有无细菌生长，生长为阳性。17大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别靛基质靛基质()甲基红甲基红()试验试验()枸橼酸盐枸橼酸盐()鉴定鉴定(型别型别)典型大肠杆菌典型大肠杆菌非典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型中间型典型中间型非典型中间型非典型中间型非典型产气

6、肠杆菌非典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌18大肠杆菌计数的报告大肠杆菌为革兰染色阴性无芽胞杆菌、发酵乳糖、产酸、产气；试验为或。只要有个菌落鉴定为大肠杆菌，其代表的肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据肉汤阳性管数查表，报告每或每样品中大肠杆菌值。19肉汤肉汤主要成分：乳糖、胆盐、胰蛋白胨。大肠杆菌因分解乳糖而产气，使小导管中可见气泡。20肉汤结果判定 培养接种前的肉汤产气为阳性不产气为阴性21琼脂上大肠杆菌的典型菌落与可疑菌落典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心典型的大肠杆菌的菌落典型的大肠杆菌的菌落非典型的大肠杆菌的菌落非典型的大肠杆菌的菌落22试

7、验原理甲基红试验()原理：本试验是用甲基红指示剂测定细菌发酵葡萄糖时产生的氢离子浓度的试验。大肠杆菌和大肠菌群能分解葡萄糖产生大量酸性产物，使甲基红指示剂变为红色。注意：培养时间不得；接种菌量浓度不宜过大，否则细菌生长受抑制，因此，接种量、试管大小应尽量标准化，否则影响结果判定与重复性差23靛基质试验()原理：细菌(如大肠埃希菌、大肠菌群等)含有色氨酸酶，将蛋白胨中的色氨酸分解，生成靛基质。靛基质与对二甲基苯甲醛作用，形成红色的玖瑰靛基质(红色的醇层，为醌型结构的红色集约化化合物)，呈红色。注意：蛋白胨的色氨酸含量与靛基质试验阳性反应密切相关，若蛋白胨水中加入的色氨酸或选用色氨酸高的胰蛋白胨做

8、靛基质试验效果更佳。24试验()原理：本试验是检查细菌利用葡萄后所产生的代谢终产物乙酰甲基甲醇的实验。细菌在葡萄糖代谢中生成丙酮酸，丙酮酸仅是中间产物。随细菌种属不同而有多种分解途径，使丙酮酸进一步分解为不同的终产物，借此鉴定菌种。注意：在加入试剂时一定要加萘酚，使其先与丁二酮和胍基复合物结合，而后再加入氢氧化钠。25若先加入氢氧化钠溶液，氢氧化钠可与培养基中蛋白胨某些成分反应，产生橙红色，造成假阳性的结果。氢氧化钠溶液的加入量不超过，如过量可与萘酚反应出现棕色，使弱阳性结果不易观察。若已知的阳性菌株，偶不出现阳性反应时，可把含试剂的培养物轻微加热株，阳性菌经加温后一般即可产生阳性反应。而阴性

9、菌株仍为阴性反应。26在试验中，为检出最小量乙酰甲基甲醇的最显著变化，结果观察可延至，但要注意氢氧化钠对萘酚的作用，不要将棕色错判为阳性结果。也可将试验管置培养后再观察结果，若无红色出现，即为阴性。27柠檬酸盐(枸橼盐)试验()原理：某些细菌可利用柠檬酸盐为碳源，同时利用铵盐为氮源提供能量而生长。注意：本试验是以细菌生长后培养基的浊度判定结果的。因此接种待试培养物过多时，容易造成假阳性结果。一般宜采用灭菌生理盐水制成菌悬液接种为好。28 试验的最佳观察结果时间靛基质试验：，；甲基红试验：，；滴加甲基红试剂，出现红色为阳性；出现黄色为阴性结果。试验：，；滴加试剂后若未出现伊红色，应再培养后再观察

10、结果。柠檬酸盐试验：，；观察有无细菌生长。有细菌生长培养基可变为蓝色。29大肠杆菌 试验靛基质试验靛基质试验甲基红试验甲基红试验试验试验柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验30第二法大肠埃希氏菌平板计数法31原理甲基伞形酮葡萄糖苷，英文缩写。是一种不产生荧光的底物。由于的大肠杆菌都具有葡萄糖苷酶，能分解葡萄糖苷，而使甲基伞形酮游离出来，在紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠杆菌阳性。对大肠杆菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。32对平板计数法的评估优势：许多研究结果都证实，方法的可靠性是相同于或高于常规方法，准确性高于疏水格滤膜法。当普通变形杆菌等背景菌或杂菌存在

11、时，对大肠杆菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解产生荧光的能力没有抑制作用。33研究还证实，大肠杆菌的荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，目前，仅发现对牡蛎不适合用方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。34本方法是通过荧光的产生判定结果的，实验过程中所使用的器皿易受洗涤剂中的荧光增白剂的影响，而产生假阳性或阴性对照显荧光的现象。需在紫外灯下观察结果与计数，时间太长对人的眼睛有损伤，实验时需特别的安全防护。利用大肠杆菌能产生葡萄糖苷酸酶的特性进行检验的方法除了以外，还有溴氯吲哚葡糖苷酸等。35平板计数法检验程序检样()稀释液，均质倍系列稀释选择个适宜稀释度的样液，接种平板紫外

12、光下，计数发荧光的菌落报告结果36检验选取个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取注入两个无菌平皿。另取样品稀释液注入一无菌平皿中，作空白对照。将预热至士的结晶紫中性红胆盐琼脂 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加 覆盖平板表层。凝固后翻转平板，培养。注：空白对照不加覆盖。37大肠杆菌平板计数与报告选择菌落数为的平板，暗室中波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以()表示。38大肠杆菌在平板上的典型菌落39 溴氯吲哚葡萄糖苷酶显色培养基技术原理：葡萄糖苷酶阳

13、性的大肠杆菌经培养后，分解酶底物中的葡萄糖苷，使溴氯吲哚游离形成蓝绿色的菌落。40显色培养基平板计数法检验程序检样()稀释液，均质倍系列稀释选择个适宜稀释度的样液，接种平板计数蓝绿色的菌落报告结果41样品的制备试验样品的制备：参考 和产品相关的具体国际标准。42接种使用无菌吸管或移液器()，吸取液体样本或其它样本的初始悬浮液()，转移至无菌平皿中。每一稀释度接种二块平皿。如有必要，重复上述操作接种样本的更高稀释度，每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。在接种后的平皿中倾注事先在水浴箱中冷却至的培养基。43小心将培养基和接种物混匀，并将平皿放在冷的水平面上待其凝固。从接种到倾注培养基不要超过。44培

14、养倒置已凝固的平皿，将其放入培养箱中培养 。但总培养时间不要超过。注：如样品经深加工，可将初始培养温度设为，培养后再提高至培养。但培养温度不要超过。45菌落计数在规定的培养结束后，选择总菌落(典型和非典型菌落)数少于、典型菌落数少于的平板，计算每一个平板上典型的葡萄糖苷酶阳性的大肠杆菌菌落数。46结果计算至少有一个平板其蓝色菌落数不少于 时，按以下公式计算：dnnvaN)1.0(21：两个稀释度所有平板蓝色菌落数之和，其中两个连续稀释度中至少有一个稀释度的蓝色菌落数不少于。：第一个稀释度平板个数。：每个平板接种的体积()。：第二个稀释度平板个数。：稀释因子，相当于第一稀释度。47如两个平板的蓝

15、色菌落数少于，按以下公式计算：dnvcNE.：两个平板蓝色菌落数之和。：每个平板接种的体积()。：平板个数（在本例中）。：稀释因子，相当于第一稀释度。48结果表达结果以两位有效数字表示。每(液体产品)或每(其它产品)中葡萄糖苷酶阳性的大肠杆菌数以两位整数(如少于时)表达。或以乘以的指数表达。49大肠杆菌显色培养基50大肠杆菌显色培养基大肠杆菌杂菌51显色培养基同时检测大肠杆菌和大肠菌群大肠杆菌大肠菌群52 产气荚膜梭状芽孢杆菌检验 53内容、标准的变更、生物学特性（菌体形态学特征、培养特性和抵抗力）、培养基和试剂、检验程序54 产气荚膜梭菌检验标准的变更 液体硫乙醇酸盐培养基英文名字由改为；步

16、骤标准新的检验方法选择性分离（亚硫酸盐多粘菌素磺胺嘧啶琼脂）（胰月示亚硫酸盐环丝氨酸琼脂）生化鉴定动力硝酸盐、牛奶发酵、卵磷脂分解牛奶发酵乳糖明胶、缓冲动力硝酸盐培养基（）、牛奶发酵55、生物学特性、生物学特性)形态与染色形态与染色 无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为大小：为()()()。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基血清的培养基 内生长时可形成荚膜。内生长时可形成荚

17、膜。56*不严格的厌氧不严格的厌氧*普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。*适宜生长温度为适宜生长温度为。*生长和繁殖速度极快，在适宜条件下代。生长和繁殖速度极快，在适宜条件下代。*在在高温下可进行快速分离纯培养，每培养高温下可进行快速分离纯培养，每培养 传种次，较易分离纯化。传种次，较易分离纯化。575859()()卵磷脂酶检查试验：用接种环取培养液点种于卵黄卵磷脂酶检查试验：用接种环取培养液点种于卵黄 琼脂平板琼脂平板(每块平板每块平板 至少可接种点至少可接种点)，于厌氧，于厌氧 培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵培

18、养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵 磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部与磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部与 周围乳白色的混浊带。周围乳白色的混浊带。60不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。61分型：分型：根据毒素和抗血清中和试验将此菌分根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成，成，和六个型。和六个型。型：最常见，引起气性坏疽和食物中型：最常见，引起气性坏疽和食物中 毒；毒；型最早由型最早由()分离，分离，所以叫卫氏魏氏梭菌所以叫卫氏魏氏梭菌 型：可引起肠炎。型：可引起肠炎。*对人致病的主要是、和型对人致病的主要是、和型 *引起食物中毒的主要是型引起食物中毒的主要

19、是型 62 检验程序检验程序 63 爆发酵检验程序检验程序续续64（）（）65 66、证实试验、证实试验 ()()纯培养：由平板上任取个黑色菌落，分别接种纯培养：由平板上任取个黑色菌落，分别接种 培养基，于培养基，于()培养，大量繁殖。培养，大量繁殖。()()菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏 染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性 粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于 菌体中央或近端。菌体中央或近端。6768()()检查动力和硝酸盐还原实验：检查动力和硝酸盐还原实验：用接种环用接种环(

20、针针)穿刺接种动力穿刺接种动力硝酸盐培养基，硝酸盐培养基，于于()培养培养.判断有无动力产气荚膜梭菌无动力；判断有无动力产气荚膜梭菌无动力；滴加硝酸盐还原试剂滴加硝酸盐还原试剂“甲萘胺液和对氨基苯甲萘胺液和对氨基苯磺酸液磺酸液”，观察硝酸盐是否被还原产气荚膜梭，观察硝酸盐是否被还原产气荚膜梭菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。69()牛乳乳糖发酵产气牛乳乳糖发酵产气“暴发酵暴发酵”试验：试验：取生长旺盛的培养取生长旺盛的培养液接种于含铁牛乳培养基，在液接种于含铁牛乳培养基，在水浴水浴中培养中培养后观察有无后观察有无“暴发酵暴发酵”现象。内不发现象。内不发酵者为阴性。酵者

21、为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大凝固酪蛋白并大 量产气，呈量产气，呈“暴风暴风雨式发酵雨式发酵”现象，但培养基不变黑。现象，但培养基不变黑。70乳糖明胶培养基标准菌与对照菌结果产气荚膜梭菌 产气变黄，放置呈液态鼠伤寒沙门氏菌 不产气，红色不变，放置呈固态71、菌数计算、菌数计算 根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计算算()()食品检样的含菌数。食品检样的含菌数。例如：稀释液的平板长有黑色菌落个，而供例如：稀释液的平板长有黑色菌落个，而供做证实试验的个菌落中有个被确证为产气荚膜梭做证实试验的个菌落中有个被确证为产气荚膜梭菌，则菌，则()()食品检样所含产气荚膜梭菌数为食品检样所含产气荚膜梭菌数为 (个个)()()72TSC厌氧培养厌氧培养含铁牛乳培养基含铁牛乳培养基73谢谢！