大肠杆菌分子克隆载体培训课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《大肠杆菌分子克隆载体培训课件.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 大肠杆菌 分子 克隆 载体 培训 课件
- 资源描述:
-
1、大肠杆菌分子克隆载大肠杆菌分子克隆载体体一、一、E.coli克隆载体的种类克隆载体的种类 1.质粒载体质粒载体复制起点来自一些天然质粒。复制起点来自一些天然质粒。2.噬菌体载体噬菌体载体,P1和和M13、fd载体,复制载体,复制起点来自噬菌体。起点来自噬菌体。3.COS质粒载体质粒载体质粒载体中插入质粒载体中插入cos片段,片段,以利于体外包装以利于体外包装 4.4.噬粒载体(噬粒载体(phagemidphagemid)有质粒和有质粒和M13、fdfd的复制起点,以质的复制起点,以质粒或噬菌体方式复制。粒或噬菌体方式复制。大肠杆菌分子克隆载体2二、质粒与质粒载体二、质粒与质粒载体 1.Ecol
2、i的质粒种类的质粒种类 1)colE1因子(大肠杆菌素因子)因子(大肠杆菌素因子)多数不能进行接多数不能进行接合转移合转移DNA,属高拷贝松弛型。,属高拷贝松弛型。2)R因子(抗药性因子)因子(抗药性因子)可接合转移可接合转移DNA,属低拷贝,属低拷贝 严紧型,严紧型,质粒较大,操作不便质粒较大,操作不便 3)F因子(性因子)因子(性因子)大肠杆菌分子克隆载体32.质粒的特点质粒的特点 1)质粒质粒DNA复制与染色体复制无关复制与染色体复制无关 2)质粒质粒DNA以超螺旋形式存在以超螺旋形式存在 3)质粒质粒DNA可以接合转移可以接合转移 4)质粒的不相容性和不相容群质粒的不相容性和不相容群
3、5)质粒质粒DNA的消除的消除化学和物理法化学和物理法(吖啶染料,吖啶染料,EtBr,高温等,高温等)6)质粒的整合质粒的整合F因子又可整合到因子又可整合到E.coli染色体中染色体中 3.质粒质粒DNA的转移的转移 1)质粒质粒DNA的转移过程的转移过程 大肠杆菌分子克隆载体4donor cellRecipient cellnick-ligation at oriTdonor cell3)分离2)tro基因表达1)重新环化DNA转移供体接合 DNA合成traT稳定化细胞 壁接触不稳定接合对性繖 毛收缩繖毛结合性繖 毛-细胞壁接触+质粒的自主转移过程质粒的自主转移过程 大肠杆菌分子克隆载体55
4、353质粒质粒DNA的转移和复制的转移和复制 大肠杆菌分子克隆载体6 2)质粒转移的必备条件质粒转移的必备条件 .转移起点转移起点(oriT),它是质粒它是质粒DNA转移时的复制起点转移时的复制起点顺顺式式 作用(作用(cis-action)ii.细胞附属物细胞附属物性纤毛,由蛋白质构成性纤毛,由蛋白质构成反式作用反式作用 .转移过程所需的全部酶类转移过程所需的全部酶类反式作用反式作用 3)质粒转移类型质粒转移类型 .自我转移(自我转移(Self-transmissible).辅助转移(辅助转移(Donation)可转移质粒仅具备可转移质粒仅具备oriT,若,若无辅助质粒,前者不会发生接合转移
5、。若辅助质粒可无辅助质粒,前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质,前者便会发生接合转移。提供所有反式作用的蛋白质,前者便会发生接合转移。.重组转移(重组转移(conduction)若质粒无若质粒无oriT,该质粒只,该质粒只有整合到辅助质粒有整合到辅助质粒DNA中,重组质粒便可转移。中,重组质粒便可转移。因此,用于克隆外源因此,用于克隆外源DNADNA的分子克隆载体,只要具的分子克隆载体,只要具备备oriToriT即可,另外两类功能基因可置于辅助质粒上,即可,另外两类功能基因可置于辅助质粒上,该质粒一般没有该质粒一般没有oriToriT,因而可以减少后者进入另一种,因而可以
6、减少后者进入另一种细胞的频率。细胞的频率。大肠杆菌分子克隆载体7+导入自主转移H+H donor无DNA转移H 辅助转移H质粒自主转移质粒自主转移R+RRR R+Notransfer+H H 重组DNA 转移质粒的辅助转移质粒的辅助转移质粒的重组转移质粒的重组转移 R-重组重组DNA分子分子 大肠杆菌分子克隆载体8 4.质粒质粒DNA的复制和调节控制的复制和调节控制 1)复制机制复制机制复制方向、终止和方式复制方向、终止和方式 2)质粒拷贝数的控制质粒拷贝数的控制抑制剂模型:高拷贝质粒需抑制剂模型:高拷贝质粒需高浓度抑制剂,低拷贝质粒需低浓度抑制剂,同高浓度抑制剂,低拷贝质粒需低浓度抑制剂,同
7、一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。3)质粒的复制调控机制质粒的复制调控机制 例子例子:ColE1质粒的复制及复制起点结构质粒的复制及复制起点结构 Boros etal.(1984)分离到一个分离到一个pBR322突变体,突变体,其拷贝数可达其拷贝数可达1000/cell或或65%总总DNA,原因是在,原因是在RNAI基因的基因的3端附近发生一次端附近发生一次GT颠换。颠换。大肠杆菌分子克隆载体9-555bpRNA II(primase)oriRNaseHColE1质粒质粒复制起点结构复制起点结构质粒质粒DNA的的复制过程复制过程 大肠杆菌分子克
8、隆载体105.大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 1)常用质粒载体的复制子常用质粒载体的复制子 质粒载体质粒载体 复制子来源复制子来源 拷贝数拷贝数 pBR322系列系列 pMB1 15-20 pUC系列系列 pMB1 500-700 pACYC系列系列 p15A 10-12 pSC101系列系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 2)质粒载体常用的遗传标记基因质粒载体常用的遗传标记基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZ 3)多克隆位点区多克隆位点区 大多数从大多数从pUCpUC系列中的多克隆位点衍生出来的系列中的多克隆位点衍生出来的
9、 大肠杆菌分子克隆载体11 6.实例实例pUC18和和pUC19 pUC系列质粒载体由系列质粒载体由Messing et al.构建,具有三个构建,具有三个显著特点:显著特点:1)分子量小,仅为)分子量小,仅为2.7KB,容纳外源,容纳外源DNA量增大量增大 2)易于检测是否有外源)易于检测是否有外源DNA插入的标记基因插入的标记基因LacZ 3)多克隆位点区)多克隆位点区 .多克隆位点成对地存在于多克隆位点成对地存在于pUC18和和pUC19中,位点排列中,位点排列顺序相同,但方向相反。顺序相同,但方向相反。这种排列方式有利于外源这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入的克隆和定向插入
10、.产生不同末端规律排列产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生两端限制酶位点产生5突起突起端(端(EcoRI和和Hind),与之相邻的两个限制酶位点产),与之相邻的两个限制酶位点产生生3突起端(突起端(SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四个),中央四个限制酶位点产生限制酶位点产生5突起端或平端。这种排列方式十分突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。片段的单向缺失和缺失片段的回收。大肠杆菌分子克隆载体12EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19Hi
11、nSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC18和和pUC19载体载体大肠杆菌分子克隆载体13 如插入片段的如插入片段的5段定向缺失段定向缺失:XbaISphIExoS1T4 DNA lingase;插入片段的插入片段的3-端亦可采用类似的方法进行端亦可采用类似的方法进行缺失(缺失(SmaISstIExoS1T4 DNA lingase)不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如例如:pBS+多克隆位点区的排列顺序是多克隆位点
12、区的排列顺序是(见图见图):假设有一假设有一EcoRIHind DNA片段,并要求在其片段,并要求在其3-末端或末端或5-端接上另外的端接上另外的DNA片段(如终止子、启动子),片段(如终止子、启动子),显然,显然,pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜,但选用系列载体的多克隆位点区是不太适宜,但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。中的多克隆位点区就能满足要求。.多克隆位点集中排列多克隆位点集中排列,有利于克隆片段的物理图谱的有利于克隆片段的物理图谱的绘制。绘制。除上述三个特点外,除上述三个特点外,pUC系列载体还可用于表达外源系列载体还可用于表达外源基因基因(LacZ启动子)。启动子)
13、。大肠杆菌分子克隆载体14Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3.0 kb)pBS载体的结构载体的结构大肠杆菌分子克隆载体15 三三.噬菌体载体噬菌体载体 1.噬菌体噬菌体载体载体 1)的结构和特点的结构和特点 i.一般结构:一般结构:48,502bp,线状,线状ds-DNA,两端具有,两端具有12n.t 5-突起(突起(5-GGGCGGCGACCT-3)该末端称为)该末端称为cos位点,可被位点,可被编码的末端酶所识别(该酶由编码的末端酶所识别(该酶由末端的末端的两个基因两个基因Nul和和A编码蛋白编码蛋白g
14、pNul和和gpA组成)组成)ii.基因结构基因结构46个基因,分为以下四类:个基因,分为以下四类:)调控基因:调控基因:C、N、CI、Cro、C决定进入溶决定进入溶源化还是裂解状态源化还是裂解状态 )DNA复制:复制:O、P、Q )重组:重组:int、xis、red和和gam )噬菌体颗粒形成与细胞裂解:头噬菌体颗粒形成与细胞裂解:头(A-F)、尾、尾(E-J)、S&R(细胞裂解)(细胞裂解)中部约中部约1/3的的DNA(b2)与与存活无关。存活无关。大肠杆菌分子克隆载体16w G T A B C D E Z U V H K I J N O P Q S R 免疫和调控整合切除、重组DNA合成
15、宿主裂解att PIkiltLOLPLNPMtMOriPRtR1ORTR2cIintexocIII relOPQSRPRCrotLOLORtR1PLtR2NPR后早期激活后期tMPMP ECI阻遏物溶源性建立和保持M L头 尾Pi大肠杆菌大肠杆菌噬菌体的基因和表达调控噬菌体的基因和表达调控大肠杆菌分子克隆载体17 2)噬菌体基因的表达噬菌体基因的表达 i.最早期转录:转录起始于最早期转录:转录起始于CI基因两侧的基因两侧的PL和和PR启动子,启动子,止于止于N和和Cro末端的末端的tL和和tR1,有的右向转录物可継续通,有的右向转录物可継续通过过O和和P止于止于tR2。ii.后早期转录:后早期
16、转录:N蛋白可使宿主细胞转录终止因子蛋白可使宿主细胞转录终止因子失活,失活,导致转录通过导致转录通过tR1、tR2和和tL进入其余早期基因区域。进入其余早期基因区域。iii.后期转录:后期转录:cro蛋白可与蛋白可与OL和和OR结合,阻止结合,阻止RNA聚合聚合酶与酶与PL和和PR结合,转录终止,此时已合成了足够多的结合,转录终止,此时已合成了足够多的控制蛋白控制蛋白Q,它对,它对PR起激活作用,导致后期基因转录。起激活作用,导致后期基因转录。iv.DNA复制:因早期转录获复制:因早期转录获DNA复制蛋白复制蛋白O和和P,双向,双向复制开始。复制开始。v.包装:包装:Nul和和A蛋白与蛋白与D
17、NA的的cos位点的识别与切割,位点的识别与切割,FI蛋白促进蛋白促进DNA进入头部蛋白,进入头部蛋白,DNA充满后,充满后,gpw和和gpF将头部封住,然后与尾部相连,形成噬菌体颗粒。将头部封住,然后与尾部相连,形成噬菌体颗粒。大肠杆菌分子克隆载体18 vi.裂解:基因裂解:基因R和和S产物形成,细菌细胞裂解,噬菌体颗产物形成,细菌细胞裂解,噬菌体颗粒释放。粒释放。vii.溶源反应:溶源反应:C和和C基因产物分别激活基因产物分别激活PE和和PI的左向的左向转录,致使转录,致使CI和和int基因表达,基因表达,CI 产物可阻止早期转录,产物可阻止早期转录,导致后期基因表达受阻。导致后期基因表达
18、受阻。对于裂解反应和溶源反应的选择,取决于感染细胞中对于裂解反应和溶源反应的选择,取决于感染细胞中一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。*当当DNA注入宿主细胞后,线状注入宿主细胞后,线状DNA首先环化为环状首先环化为环状DNA,这种环化有以下几点好处:,这种环化有以下几点好处:a.若为单向复制,不管从何处开始复制,全基因组均若为单向复制,不管从何处开始复制,全基因组均 可全部复制可全部复制 b.噬菌体噬菌体DNA插入宿主染色体插入宿主染色体DNA,只需一次位点,只需一次位点特异性重组特异性重组 c.拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋
19、拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋 d.受损的基因组增大了存活的可能性,因为双向复受损的基因组增大了存活的可能性,因为双向复制不会受阻于制不会受阻于 损伤的损伤的DNA链,而单向复制就不能通过链,而单向复制就不能通过 大肠杆菌分子克隆载体19 3)DNA的复制的复制细胞外细胞内大肠杆菌分子克隆载体204)DNA的包装过程的包装过程 l l 头头尾连接器由尾连接器由12分子分子gpB构成中空结构,构成中空结构,groE1和和groES负责装配负责装配 l l pX由由10个杂合的个杂合的gpC和和gpE构成,使连接器定位构成,使连接器定位 l l gpW和和gpF结合在连接器上,防止结合在连接
20、器上,防止DNA外泄,提供尾部外泄,提供尾部粘着点粘着点末端酶末端酶由两基因产物组成(由两基因产物组成(Nul和和A),),gpNul2-gpA1(20,444 x 2+72,280=113,168)该酶具有以下多种酶活性该酶具有以下多种酶活性:1)特异)特异DNA位点结合;位点结合;2)特异)特异位点切口形成;位点切口形成;3)头前体结合;)头前体结合;4)gpFI结合;结合;5)cos位点位点变性;变性;6)DNA转位;转位;7)DNA序列扫描;序列扫描;8)ATP结合;结合;9)ATP水解。水解。因此,头部蛋白因此,头部蛋白gpEgpE和和gpDgpD以及包装蛋白以及包装蛋白gpAgpA
展开阅读全文