基因工程3大肠杆菌表达系统课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《基因工程3大肠杆菌表达系统课件.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程 大肠杆菌 表达 系统 课件
- 资源描述:
-
1、前言前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物大量蛋白质产物即实现基因的高效表达。即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下外源基因片段,拼接到另一个基因达活动,即剪切下外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得原生物活性又可高产的表达表达体系中,使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。产物。第三章第三章 真核基因在大肠
2、杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达基因工程3大肠杆菌表达系统1最佳的基因表达体系:最佳的基因表达体系:目的基因的表达产量高目的基因的表达产量高;表达产物稳定表达产物稳定;生物活性高生物活性高;表达产物容易分离纯化。表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略第一节基因的表达系统与表达策略基因工程3大肠杆菌表达系统2宿主细胞的选择宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1 1、容易获得较高浓度的细胞;、容易获得较高浓度的细胞;2 2、能利用易得廉价原料;、能利用易得廉价原料;3 3、不致病、不产生内毒素;、不致病、不产生内毒素;4 4、发热量低
3、、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态;、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态;5 5、容易进行代谢调控;、容易进行代谢调控;6 6、容易进行、容易进行DNADNA重组技术操作;重组技术操作;7 7、产物的产量、产率高,、产物的产量、产率高,8 8、产物容易提取纯化。、产物容易提取纯化。基因工程3大肠杆菌表达系统3宿主细胞分为两大类:宿主细胞分为两大类:1 1、原核细胞:常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、原核细胞:常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等;链霉菌等;2 2、真核细胞:常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物、真核细胞:常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。细胞等。基因工程3大肠杆菌表达系统4
4、一、真核基因的大肠杆菌表达体系一、真核基因的大肠杆菌表达体系 目前,已被用于表达外源蛋白质的表达系目前,已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌(大肠杆菌和枯草杆菌)、酵母、昆统有细菌(大肠杆菌和枯草杆菌)、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言,大虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言,大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。肠杆菌表达系统具有明显的优越性。基因工程3大肠杆菌表达系统5大肠杆菌表达体系的优越性大肠杆菌表达体系的优越性:1.1.对大肠杆菌的背景知识(完成基因组对大肠杆菌的背景知识(完成基因组全测序哦),特别是基因表达调控的分全测序哦),特别是基因表达调控的分子机理有(乳糖操纵子)深
5、刻的了解;子机理有(乳糖操纵子)深刻的了解;2.2.是一种安全的基因工程实验体系,拥是一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体;体;3.3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达;菌细胞中实现有效、高水平的表达;4.4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。低廉,易用于批量生产。基因工程3大肠杆菌表达系统6大肠杆菌中表达体系的不足大肠杆菌中表达体系的不足:1.1.真核基因,在结构上同原核基因之间真核基因,在结构上同原核基因之间存在着
6、很大的差别。存在着很大的差别。2.2.真核基因的转录信号同原核的不同。真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的细菌的RNARNA聚合酶不能识别真核的启聚合酶不能识别真核的启动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。录终止信号功能的核苷酸序列。3.3.真核基因真核基因mRNAmRNA的分子结构同细菌的的分子结构同细菌的有所差异,影响真核基因有所差异,影响真核基因mRNAmRNA稳定性。稳定性。基因工程3大肠杆菌表达系统74.4.许多真核基因的蛋白质产物,都要经许多真核基因的蛋白质产物,都要经过转译后的加工修饰(正确折叠和组过转译后的加工修饰(正
7、确折叠和组装),而大多数的这类修饰作用在细装),而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在;菌细胞中并不存在;5.5.细菌的蛋白酶,能够识别外来的真核细菌的蛋白酶,能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子,并把它们基因所表达的蛋白质分子,并把它们降解掉。降解掉。6.6.大肠杆菌周质内存在各种内毒素。大肠杆菌周质内存在各种内毒素。基因工程3大肠杆菌表达系统8克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件 最基本条件最基本条件:应该能够进行正常的转录:应该能够进行正常的转录和转译,以及在正常情况下还与转译和转译,以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有后加工及新生多肽在细胞中
8、的分布有关。关。启动子启动子、终止子终止子以及正确以及正确读码框读码框(ORF)。基因工程3大肠杆菌表达系统9重要条件重要条件:编码的蛋白质产物应能维持正常的稳编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。定性。具有核糖体结合位点;具有核糖体结合位点;具有强启动子;具有强启动子;基因工程3大肠杆菌表达系统10二、大肠杆菌的表达载体二、大肠杆菌的表达载体1、大肠杆菌表达载体的基本成分、大肠杆菌表达载体的基本成分TTGACA。TATAAT-3517-10PRTAAGGAGG(N)8ATG(91%)GTG(8%)TTG(1%)编码序列编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBS基因工程3大肠杆菌表达系
9、统11外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子启动子 终止子终止子 核糖体结合位点核糖体结合位点 密码子密码子 质粒拷贝数质粒拷贝数转录水平转录水平翻译水平翻译水平基因工程3大肠杆菌表达系统12(1)启动子)启动子 要使克隆的外源基因高水平表达的最佳要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子,必须具备以下几个条件:启动子,必须具备以下几个条件:1)必须是一个强启动子。)必须是一个强启动子。2)这个启动子应能呈现一种低限的基础表达)这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。重要的条
10、件。3)这种启动子应是诱导型的,能通过简单的)这种启动子应是诱导型的,能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导,如物理方式使用廉价的诱导物而得以诱导,如物理(如热)和化学(如(如热)和化学(如IPTG)诱导)诱导。基因工程3大肠杆菌表达系统13(2)转录终止子)转录终止子*当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时,便会使该启动子的功能受到抑制。子时,便会使该启动子的功能受到抑制。启动启动子封堵作用子封堵作用*在克隆基因编码区的在克隆基因编码区的3-末端接上一个有效的转末端接上一个有效的转录终止子,便能够阻止转录通读。录终止子,便能够阻止转录通读。此
11、外,转录终止子还能增强此外,转录终止子还能增强mRNA分子的稳分子的稳定性,从而大大提高蛋白质产物的水平。定性,从而大大提高蛋白质产物的水平。基因工程3大肠杆菌表达系统14(3)翻译起始序列)翻译起始序列 mRNA转录本转录本5端的独特的结构特征(核端的独特的结构特征(核糖体结合位点,糖体结合位点,RBS),是决定),是决定mRNA翻译效翻译效率的主要因素。率的主要因素。至今,仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保至今,仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构,但却已经发展出许多种可以用来有效地降守结构,但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在低在mRNA转录本转录本5-末端形成二级结构的实验
12、方末端形成二级结构的实验方法,从而提高克隆的外源基因的表达效率。法,从而提高克隆的外源基因的表达效率。例如例如:在在RBS序列中增加序列中增加AT含量;含量;诱发特异碱基诱发特异碱基发生定点突变;发生定点突变;以及使用翻译偶联系统进行克隆基以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。因的表达。基因工程3大肠杆菌表达系统15(4)翻译增强子)翻译增强子 大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件,能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的件,能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子翻译
13、增强子。例如:例如:T7噬菌体基因噬菌体基因10的前导序列(的前导序列(g10-L)、)、以大肠杆菌以大肠杆菌atpE基因为代表的一些基因为代表的一些mRNA分子分子5-UTR中的富含中的富含U的区段,以及直接位于的区段,以及直接位于T7基基因起始密码子下游的因起始密码子下游的“下游元件下游元件”等。等。分子机制不明。分子机制不明。基因工程3大肠杆菌表达系统16(5)翻译终止密码)翻译终止密码 对对mRNA翻译终止而言,一个必不可少的条翻译终止而言,一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此,在构建大肠杆件是必须存在终止密码子。因此,在构建大肠杆菌表达载体时,通常安置上全部的三个终止密码菌表
14、达载体时,通常安置上全部的三个终止密码子,以便阻止发生核糖体的子,以便阻止发生核糖体的“跳跃跳跃”现象。现象。已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA,尤其,尤其是当连上一个是当连上一个U而形成而形成UAAU四联核苷酸的情况下,四联核苷酸的情况下,翻译终止的效率进一步提高。翻译终止的效率进一步提高。基因工程3大肠杆菌表达系统172、常用的大肠杆菌表达载体、常用的大肠杆菌表达载体 迄今为止,基因工程学家已经设计并构建了迄今为止,基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。表达载体系统。最常
15、用的:最常用的:噬菌体的噬菌体的PL启动子,大肠杆启动子,大肠杆菌的菌的Lac启动子、启动子、Trp启动子,以及启动子,以及pBR322质粒的质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。成的。基因工程3大肠杆菌表达系统18三、大肠杆菌的转化方法三、大肠杆菌的转化方法1、Cohen转化法转化法1972年年Cohen改进而成,是目前最常用的方法。改进而成,是目前最常用的方法。操作步骤:操作步骤:(1)将处于对数生长期的新鲜培养物()将处于对数生长期的新鲜培养物(0.5-0.6OD),于,于4,4000转转/分钟离心分钟离心10分钟,回收细菌细胞;分钟,回收细菌细胞;(
16、2)将细胞用)将细胞用0的的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀,溶液重新悬浮细胞沉淀,以诱导细胞感受态产生;以诱导细胞感受态产生;(3)加入适量的)加入适量的DNA后,于后,于42 热处理热处理90秒;秒;(4)将混合物快速转移到冰浴中,是细胞冷却)将混合物快速转移到冰浴中,是细胞冷却1-2分钟,分钟,加入适当的培养基在加入适当的培养基在37 培养培养45分钟,使细胞复苏,并表分钟,使细胞复苏,并表达质粒所携带的转化基因;达质粒所携带的转化基因;(5)选择培养基培养,选择转化体。)选择培养基培养,选择转化体。基因工程3大肠杆菌表达系统192、Hanahan转化法转化法 1983年
17、由年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面,除了用的诱导方面,除了用CaCl2和和MnCl2等二价离子按一等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外,还利用二甲亚砜定形式组合方式处理细胞外,还利用二甲亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇()、二硫苏糖醇(DTT)和氯化六氨合高钴)和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞,其它方面与上法相同。等进一步处理细胞,其它方面与上法相同。这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞,可使这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞,可使转化效率提高转化效率提高100-1000倍,而且对大小质粒都能进行倍,而且对大小质粒都能进行有效的转化。有效
18、的转化。值得注意的是:值得注意的是:此法要求的条件高,对外界污染此法要求的条件高,对外界污染物极其敏感,对各方面的要求很高。因此,只在极物极其敏感,对各方面的要求很高。因此,只在极少数情况下才使用此法。少数情况下才使用此法。基因工程3大肠杆菌表达系统203、电转化法、电转化法基因工程3大肠杆菌表达系统21 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和时间和DNA浓度等参数的影响。浓度等参数的影响。转化效率:转化效率:108-109转化体转化体/g DNA。当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致50%-70%细菌死亡时,
19、转化效率达到最高。细菌死亡时,转化效率达到最高。基因工程3大肠杆菌表达系统22 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。制备用于电转化的感受态细胞相对容易。当细菌长到对数中期,冷却、离心,然后用当细菌长到对数中期,冷却、离心,然后用冷却的去离子水反复清洗,最后用冷却的去离子水反复清洗,最后用10%甘油重甘油重悬细胞,使其浓度为悬细胞,使其浓度为3 1010细胞细胞/毫升,在干冰毫升,在干冰或液氮中速冻后置于或液氮中速冻后置于-70 贮存。贮存。转化必须在转化必须在0-4 下进行。下进行。如果在室温下操作,转化效率会大大降低。如果在室温下操作,转化效率会大大降低。基因工程3大肠杆菌表达系统23四、克
20、隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达1、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位*克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位:克隆在大肠杆菌细胞中的外源基因的表达部位:细胞质;细胞周质;分泌到细胞外细胞质;细胞周质;分泌到细胞外 这三种表达部位各有不同的优缺点,而且对这三种表达部位各有不同的优缺点,而且对表达量和表达产物的制备有很大关系。表达量和表达产物的制备有很大关系。基因工程3大肠杆菌表达系统24在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点表达部位表达部位 优点优点 缺点缺点细
21、胞质细胞质 1、形成包涵体形成包涵体 1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性 (1)蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离)蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 2、还原的环境不利于二硫键的形成、还原的环境不利于二硫键的形成 (2)蛋白质受保护而免受胞内酶的降解)蛋白质受保护而免受胞内酶的降解 (3)蛋白质没有活性,不会使细胞受伤害)蛋白质没有活性,不会使细胞受伤害 2、表达的质粒载体构建比较简单、表达的质粒载体构建比较简单 周质周质 1、周质中蛋白质种类较少,纯化简单、周质中蛋白质种类较少,纯化简单 1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运、信号肽并非总是有助于
22、蛋白质的转运 2、蛋白质酶解程度不严重、蛋白质酶解程度不严重 2、有可能形成包涵体、有可能形成包涵体 3、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠 4、蛋白质、蛋白质N-末端结构真实末端结构真实胞外胞外 1、蛋白质的酶解作用程度很底、蛋白质的酶解作用程度很底 1、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通 2、目标蛋白的纯化容易,由于分泌到胞外的、目标蛋白的纯化容易,由于分泌到胞外的 常不会分泌到胞外常不会分泌到胞外 蛋白种类少蛋白种类少 2、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释,因、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释,因 3、增进了蛋白质的折叠
23、作用、增进了蛋白质的折叠作用 此目标蛋白的得率较低此目标蛋白的得率较低 4、蛋白质、蛋白质N-末端结构真实末端结构真实基因工程3大肠杆菌表达系统25*Talmadge和和Gilbert(1982)将外源蛋白质在)将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果:大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果:细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右,而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素左右,而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了原的半衰期延长了10倍以上。(倍以上。(原因:细胞周质原因:细胞周质中蛋白酶的含量低中蛋白酶的含量低)到目前为止,这方面的技术
24、还很不成熟,外泌率低。到目前为止,这方面的技术还很不成熟,外泌率低。*使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中,是获得蛋白质稳定性的最佳途径。培养基中,是获得蛋白质稳定性的最佳途径。基因工程3大肠杆菌表达系统262、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性 当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时,我们往往会认为这是由于转现其功能表达时,我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明,克隆的外源基
25、因即便是中就有许多实验表明,克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达,也并不一定就意味在大肠杆菌中得到了表达,也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。着它的多肽产物是稳定的。影响因素包括:影响因素包括:基因工程3大肠杆菌表达系统27(1)蛋白质的降解作用)蛋白质的降解作用 在大肠杆菌的细胞中,含有大量的各种类型的蛋白酶,在大肠杆菌的细胞中,含有大量的各种类型的蛋白酶,广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位,参与许多方广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位,参与许多方面的代谢活动,包括选择性地酶解异常的蛋白质。面的代谢活动,包括选择性地酶解异常的蛋白质。已知有许多因素,如已知有许多因素,如不完全多
展开阅读全文