医学课件-坂崎肠杆菌检验教学课件.ppt

1、阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌检验检验.本标准与GB/T 4789.40-2008 相比，主要变化如下：修改了标准的中英文名称；删除了附录A 中A.3。.E En nt te er ro ob ba ac ct te er r s sa ak ka az za ak ki ii i(E ES)S)肠杆菌科肠杆菌属阴沟肠杆菌埃希氏菌属克雷伯氏菌属志贺氏菌属沙门氏菌属.内内容容第第一一部部分：分：一一般般特特征征第第二二部部分：分：流流行行病病学学特特征征第第三三部部分分：E ES S的的检检验验.第第一一部部分：分：一一般般特特征征一一命命名名二二培培养养特特征征三三生生化化反反应应四四抵抵抗抗力力五五增

2、增殖殖能能力力六六致致病病性性.1 19 98 80 0年年之之前前一一直直被被称称为为黄黄色色阴阴沟沟肠肠杆杆菌菌。D DN NA A-D DN NA A杂杂交交 生生化化反反应应 黄黄色色素素 抗抗生生素素敏敏感感性性 一、命名.二、二、培培养养特特征征 G G无无芽芽孢孢杆杆菌，菌，兼兼性性厌厌氧，氧，在在6 6-4 47 7范范围围内内均均可可生生长，长，适适温温3 35 5-3 37 7 营营养养要要求求不不高：高：V VR RB BG GA A、T TS SA A、N NA A、M MA AC C、E EM MB B、其其他他与与其其他他常常见见肠肠杆杆菌菌相相似似.三、三、生生化

3、化反反应应 生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+-葡萄糖苷酶+.ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶KCN生长v发酵:蔗糖()卫矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黄色素()注：90-100；()：75-89%；V ：25-74；()：10-24；：0-9.第三部分第三部分食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验.主主要要内内容容一、一、制制订订的的主主要要依依据据二、二、

4、食食品品卫卫生生微微生生物物学学检检验验 阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌检检验验.制订的主要依据制订的主要依据1.ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii）方法；2.美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；3.2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法

5、的比较研究；4.雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法；5.阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。.SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三部分：荧光PCR方法.常见选择性培养基常见选择性培养基 D DF FI I(O Ox xo oi id d,U UK)K)E ES SI IA A(A AE ES,S,F Fr ra an nc ce)e)R RF F（R R&F F L La ab bo or ra at to or ri ie es s，S Sw wi it tz ze er rl la an nd d）O OK K m me ed di iu um

6、m 其其他他：国国内内阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌显显色色培培养养基、基、C CE ES S(M Me er rc ck,k,G Ge er rm ma an ny)y)，N NA A+-M MU UG G.显显色色培培养养基基的的特特点点-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶活活性性指指示示剂：剂：1.5-溴溴-4-氯氯-3-吲吲哚哚-，D D-吡吡喃喃葡葡糖糖甙甙（X X G Gl lc c）2.2.4 4-甲甲基基伞伞形形酮酮-D D-葡葡糖糖苷苷（-M MU UG G）3.3.4 4-邻邻硝硝基基苯苯-D D-吡吡喃喃葡葡糖糖甙甙 .选择性培养基的选择选择性培养基的选择1 1.FDAFDA方法使用方法使用VR

7、BGAVRBGA，ISO ISO 方法中使用方法中使用ESIAESIA，本方，本方法中我们选用法中我们选用DFIDFI。2.ESIA2.ESIA和和DFIDFI的基本原理相似，二者都是根据的基本原理相似，二者都是根据ESES能能产生产生-葡萄糖苷酶，分解底物葡萄糖苷酶，分解底物XaGlcXaGlc产生有色菌产生有色菌落。落。3.VRBGA3.VRBGA对对ESES的选择性差，的选择性差，ESES、阴沟肠杆菌和成团、阴沟肠杆菌和成团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。即：不

8、能观察到即：不能观察到ESES的特征性菌落。的特征性菌落。.显色培养基的选择性较好显色培养基的选择性较好 DFIDFI对对ESES的选择性较好，的选择性较好，ESES形成的蓝绿色特征性形成的蓝绿色特征性菌落易于辨认，而且：菌落易于辨认，而且：1.1.硫化氢指示剂可以区分硫化氢指示剂可以区分ESES和产生少量和产生少量-葡萄糖苷酶但葡萄糖苷酶但H H2 2S S阳性菌株（如普通变形杆菌）。阳性菌株（如普通变形杆菌）。2.2.ESES都可以在都可以在DFIDFI平板上生长并产生蓝绿色菌落平板上生长并产生蓝绿色菌落3.3.其他常见菌在其他常见菌在DFIDFI平板的菌落颜色平板的菌落颜色a.a.白色菌

9、落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等的多种菌等b.b.黄色菌落：赫氏埃希氏菌黄色菌落：赫氏埃希氏菌c.c.黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种 ESIA:ESIA:蓝蓝色，色，1-3mm1-3mm18.选择性增菌肉汤的选择选择性增菌肉汤的选择 FDAFDA方法选择方法选择EEEE肉汤，肉汤，ISOISO方法选择方法选择mLST-VmmLST-Vm，即在，即在LSTLST中加入中加入NaclNacl和和VmVm。本标准使用。本标准使用mLST-VmmLST-Vm。EEEE肉汤适

10、合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能对对ESES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希氏菌等）相比，肠埃希氏菌等）相比，ESES具有较高的耐渗透压能具有较高的耐渗透压能力。加入力。加入0.5M0.5M的的NaclNacl在保证在保证ESES良好生长的同时，良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。可以有效地抑制上述其他细菌的生长。VmVm可有效地抑制可有效地抑制G+G+菌的生长。而较高的生长温度菌的生长。而较高的生长温度可

11、以进一步抑制其他细菌的生长。可以进一步抑制其他细菌的生长。.二、二、食食品品卫卫生生微微生生物物学学检检验验阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌检检验验.本本标标准准修修改改采采用用1.ISO/TS 22964（1st edition 2006-02-01）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii2.FDA July 2002;Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant F

12、ormula.第第一一法法：阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌的的检检验验第第二二法法：阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌的的计计数数.第第一一法法 阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌的的检检验验.阪崎肠杆菌检验程序阪崎肠杆菌检验程序 报 告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g（mL）+BPW稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选择性增菌选择性分离生 化 鉴 定100 g（mL）.5.5.1 1 前前增增菌菌和和增增菌菌 左左图：未混合；图：未混合；右图：混合后。右图：混合后。加样入已预热到44的BP中.5.2 分离分离DFID

13、FI36361124 h24 h2h2h.TSATSA：25 25 培养后培养后典型典型ESES：黄色：黄色阴性对照阴性对照E.coli E.coli ATCC 25922ATCC 25922：白色菌落：白色菌落黄黄色色素素.5.3 鉴定（生化反应）鉴定（生化反应）生化试验生化试验特征特征黄色素产生氧化酶L-赖氨酸脱羧酶L-鸟氨酸脱羧酶（）L-精氨酸双水解酶柠檬酸水解()发酵：D-山梨醇（）L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙注：99%阳性；99%阴性；（）90%99%阳性；（）90%-99%阴性。.商商业业生生化化鉴鉴定定系系统统的的应应用用 推推荐荐使使用用的的E ES S生生化化鉴鉴定定

14、方方法法有有很很多，多，主主要要有有A AP PI I 2 20 0E E，I ID D 3 32 2E E，B Bi io ol lo og g G GN N2 2 M Mi ic cr ro oP Pl la at te e，V VI IT TE EK K G GN NI I+等等。上上述述方方法法都都比比较较成成熟，熟，稳稳定定性性较较好，好，已已被被许许多多国国家家和和组组织织的的标标准准采采用。用。在在肠肠杆杆菌菌的的生生化化鉴鉴定定中中使使用用最最广广泛泛的的是是A AP PI I 2 20 0E E和和V Vi it te ek k G GN NI I+。.A AP PI I 2

15、 20 0E E生生化化鉴鉴定定板板典典型型生生化化反反应应图图示示 API 20E反应编码反应编码API 20E结果评价结果评价3345 373Excellent identification3305 173Excellent identification3305 363Very good identification3305 373Good identification.V VI IT TE EK K-G GN NI I+.质质量量控控制制 选择标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离选择标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验的操作过程进行质量控制。对整个实验的操作过程进行质量控制。.第第二二法法 阪阪崎崎肠肠杆杆菌菌的的计计数数.3 3管管M MP PN N法法.SN标准标准.