人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨培训课件.ppt

1、L/O/G/O人类结肠癌细胞的人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相抗增殖活性及其相关分子机理的探讨关分子机理的探讨论文信息论文信息1.文章所刊登的学术杂志：Chemico-Biological Interactions(化学与生物相互作用)发表时间：2011年5月3日2.文章作者：韩国首尔国立大学药学院 Hwa-Jin Chung，Sang Kook Lee韩国首尔梨花女子大学药学院 Hee-Kyung Rhee，Hea-Young Park Choo3.关键词：苯并呋喃并萘二酮衍生物(Benzonaphthofurandione derivative)癌细胞 HCL116抗癌活性(Antitum

2、or activity)G0/G1期的细胞周期停滞(G0/G1 cell cycle arrest)表皮生长因子受体/雷帕霉素靶蛋白信号发送(EGFR/mTOR signaling)2人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨ppt结构结构1.Introduction2.Methods and results3.Discussions3人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨主要实验流程主要实验流程1.测定对比8e和阿霉素对癌细胞的增殖抑制效力（以半抑制浓度表示），并用倒置相差显微镜观察癌细胞前后形态2.用不同浓度的8e处理癌细胞24h和48h，并用流式细胞术分析癌细胞的细胞周期

3、分布4.提取第2步得到的癌细胞中与细胞周期和信号转导相关的蛋白，并用Western blot技术分析这些蛋白质的表达水平，以推测8e的抑癌机理3.将癌细胞移植到无胸腺小鼠身上使其长成肿瘤，分析8e和阿霉素对肿瘤生长的抑制效果，并对肿瘤组织进行免疫组化分析4人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨1.Introduction背景：结肠癌是世界范围内的头号癌症杀手之一，每年有大约一百万的新增病例。尽管全球结肠癌的发病率在逐步下降，但近年来由于饮食习惯的西化，亚洲国家结肠癌患者数目显着上升。因此仍有必要开发新型的抗结肠癌药物。阿霉素(Doxorubicin)，一种蒽环类化合物，是临床上用来作

4、为治疗癌症的药物。下面我们来看看8e和阿霉素(Doxorubicin)的化学结构式。5人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨8e8e的结构式的结构式6人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨阿霉素阿霉素(Doxorubicin)(Doxorubicin)【作用与用途】阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，对多种肿瘤均有作用，属非周期特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但有一定的毒副作用。【毒性反应】白细胞和血小板减少，约60%80%的病人可发生；100%的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为

5、心律失常，ST-T改变(ST和T 分别指两种心电波)、恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色。7人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨2.Methods and results 2.1化学试剂（Chemicals）（略）2.2合成8e（Synthesis of compound 8e）：按已发表的文献提供的化学合成方法人工合成。2.3癌细胞的培养（Cell culture）：人结肠癌细胞HCL116由美国模式培养物保藏所（ATCC）提供，用加富的RPMI1640培养基培养，该培养基另外加入了10%热灭活的胎牛血清（FBS），100单位/mL青霉

6、素（盘尼西林），100ug/mL链霉素，250ng/mL两性霉素B。置于含5%CO2的控湿氛围中培养。8人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨2.4 8e8e和阿霉素对癌细胞和阿霉素对癌细胞抑制抑制效效力的测力的测定定：癌细胞HCL116(以1104 个/mL的密度植于96孔盘)分别加入不同浓度的8e或阿霉素(Doxorubicin)后置于37含5%CO2的控湿氛围中培养72h。经其他步骤处理后用570nm波长测量吸光度以求得存活细胞的数量，并用非线性回归分析的方法计算8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度（IC50）。9人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨8e8e和阿霉素对癌

7、细胞的半抑制浓度和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度，10人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨结果结果计算结果表明阿霉素对癌细胞的半抑制浓度为46.2 nm/L，而8e对癌细胞的半抑制浓度为52.9nm/L，8e的抑癌效力稍逊于阿霉素。用8e处理癌细胞24h和48h后用倒置相差显微镜观察癌细胞的形态。虽然癌细胞存活的数量随8e浓度增大而递减，但实验组的癌细胞与对照组相比并没有明显的形态学变化。11人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨倒置相差显微镜对倒置相差显微镜对8e处理后癌细胞的观察结果处理后癌细胞的观察结果8e处理后癌细胞变得稀疏，但没有明显的形态学变化。12人类结肠癌细胞

8、的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨2.5 8e 8e对癌细胞细胞周期分布的影响对癌细胞细胞周期分布的影响 用磷酸盐缓冲液配制25、50、75nm/L的8e溶液为实验组，并以磷酸缓冲液为空白对照，分别处理癌细胞，在24h和48h后用流式细胞仪分析癌细胞的细胞周期分布。13人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨流式细胞术分析细胞周期流式细胞术分析细胞周期分布的结果分布的结果14人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨结果表明细胞周期停滞在G0/G1时期与8e的浓度有关15人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨 2.6蛋白质印迹分析蛋白质印迹分析将经过25、50、75nm

9、/L的8e处理24和48小时后的癌细胞的总蛋白质提取出来后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离并电转移到聚偏二氟乙烯薄膜上，薄膜用特制的缓冲液在室温下处理1h，接着用以磷酸盐缓冲液稀释的特异性抗体进一步在4下过夜处理。然后用特制的缓冲液洗涤后，薄膜在室温下用二抗标记的辣根过氧化物酶继续处理2h，然后用荧光影像分析仪配合辣根过氧化物酶荧光检测试剂盒来显像。16人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨 蛋白质免疫印迹分析蛋白质免疫印迹分析图谱图谱17人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨蛋白质免疫印迹分析蛋白质免疫印迹分析图谱图谱18人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子

10、机理的探讨 2.7小鼠小鼠体内体内肿瘤生长抑制实验肿瘤生长抑制实验实验采用6星期大的雄性无胸腺小鼠(athymic mice)。在第0天将HCL116癌细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部，当肿瘤体积长到9095mm3时（约在接种后第7天）开始用8e或阿霉素对小鼠进行治疗。实验之前小鼠被随机分为6组（5个实验组和1个对照组），每组6只。5个实验组：阿霉素3mg/kg/day,8e 2mg/kg/day,8e 5mg/kg/day,8e 10mg/kg/day,8e(5mg/kg/day)阿霉素(3mg/kg/day)8e和阿霉素分别溶于磷酸盐缓冲液并设置1个只有溶剂的空白对照。5组药物都是以腹

11、膜内注射的方式给药，每周3次，持续3周，每组共给药9次。19人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨小鼠体重和肿瘤体积的变化小鼠体重和肿瘤体积的变化自接种癌细胞当天起，于第0、9、18、24、28天对小鼠进行体重称量和肿瘤体积的测量。（在第28天实验结束可以将小鼠身上的肿瘤摘取下来通过液体推排法测量肿瘤的体积，但由于实验过程中在不能摘取肿瘤的情况下也要测量肿瘤的体积，因此本实验中肿瘤体积的测量是通过较为精准地测量肿瘤的长宽高，然后用公式（体积=长 宽高/6）计算出来的。不同时期的小鼠体重以柱状图表示，肿瘤体积以折线图表示。20人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨小鼠与摘取下

12、来的肿瘤小鼠与摘取下来的肿瘤21人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨小鼠体重的变化小鼠体重的变化22人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨肿瘤体积的变化肿瘤体积的变化与对照相比的肿瘤抑制率23人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨对肿瘤组织进行免疫组化分析对肿瘤组织进行免疫组化分析用抗Ki-67抗体对肿瘤组织进行免疫组化分析以检测癌细胞的增殖情况。Ki-67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原（PCNA）。Ki-67是目前多种恶性肿瘤尤其是乳腺癌研究中的热门生物标志物，可以通过对Ki-67的检测了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。24人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分

13、子机理的探讨肿瘤的免疫组化分析结果肿瘤的免疫组化分析结果分析结果表明8e抑制了增殖细胞核抗原Ki-67的表达。25人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨小鼠治疗实验的结论小鼠治疗实验的结论经过3周的药物治疗之后，10mg/kg/day的那个实验组与对照组相比，肿瘤的抑制达到58.7%。与对照组相比，实验组小鼠没有观察到明显的体重变化和副作用。同时，免疫组织学分析表明，在异种移植的癌细胞中，8e抑制了增殖生物标志物Ki-67的表达，表明8e的确有效地抑制了癌细胞在体内的增殖。26人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨3.Discussion（重点）（重点）在最初的研究中作者发

14、现8e对多种人类癌细胞系都有生长抑制作用，而在固态肿瘤（实体肿瘤）中人结肠癌细胞HCL116的生长对8e的抑制活性尤为敏感。因此他们设计实验，从细胞周期调控蛋白的表达和细胞信号传导途径两个方面进一步研究8e对人结肠癌细胞的作用机理。27人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨cyclin与CDK的功能：一般认为细胞周期蛋白（cyclins）和周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是细胞周期的的调控者并通过相互结合形成cyclin-CDK复合物来起作用。在细胞周期的不同时期，不同的cyclin-CDK复合物通过使特异的转录因子或其他蛋白质的磷酸化，开启或关闭某些基因的表达，或直接调节某些蛋白质的

15、活性，从而推动细胞周期的更替。但是癌细胞的细胞周期调控蛋白失控并导致细胞的异常增殖。Part 128人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨细胞周期的一般模式细胞周期的一般模式G1/S检控点CDK4、CDK6与cyclinD形成的复合物主要在G1期起作用，促进G1/S转变CDK2 与cyclinE形成的复合物作用于S期的起始阶段CDK2与 cyclinA形成的复合物的作用贯穿于整个S期CDK1与cyclinA或cyclinB（主要是cyclinB)形成的复合物则在G2/M转变中发挥作用29人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨G1/S转变的调控机理转变的调控机理在细胞周期G1

16、/S转变过程中，首先由cyclinD（D1、D2、D3）与CDK4和CDK6结合形成cyclinD-CDK复合物，然后进入细胞核内，CDK的某些位点被CAK（周期蛋白依赖性激酶活性激酶）磷酸化。磷化后具有激酶活性的cyclinD-CDK复合物使pRb-E2F复合物（E2F是一种转录活化因子）中的pRb（视网膜母细胞瘤蛋白，一种细胞周期抑制蛋白）磷酸化为p-pRb，但pRb上有多个可磷酸化的位点，仅仅靠cyclinD-CDK对其进行磷酸化是不够的，随后还需要cyclinE-CDK2继续对pRb上的其他位点进行磷酸化，以及cyclinA/B依赖性激酶的活化来维持p-pRb的高度磷酸化状态。p-pR

17、b不具有与E2F结合的活性，因而释放转录因子E2F。被释放的E2F进入核内结合一系列的基因启动区（c-myc、b-myb、cdc2等）促进这些基因的转录，使细胞通过G1/S检控点，从G1期进入到S期。30人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨简意图简意图促分裂信号CyclinD水平升高CDK2CDK4cyclinD-CDK2cyclinD-CDK4pRb-E2F p-pRbpRb 磷酸化E2F活化相关基因的转录细胞通过G1/S检控点，从G1期转变到S期cyclinE-CDK2继续磷酸化cyclinA/B-CDK维持高度磷酸化不再结合E2F进入 核内31人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相

18、关分子机理的探讨增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原 PCNAPCNAPCNA是一种由三个相同亚基组成的，总相对分子质量为29kD的环状同源三聚体蛋白，在细胞核内合成并分布于细胞核内，是真核生物DNA聚合酶的辅助蛋白。PCNA的三聚体环形结构环绕着双链DNA，起到滑动发夹的作用，相当于原核生物DNA聚合酶的亚基，极大地增强了真核生物DNA聚合酶的持续合成能力，而且PCNA也参与DNA的损伤修复。32人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨 8e 8e对细胞周期调控蛋白表达水平的影响对细胞周期调控蛋白表达水平的影响34人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨如蛋白质印迹图谱所示，（1）表

19、达水平上调的因子有：细胞周期抑制蛋白p21；（2）表达水平下调的因子有：cyclin D1、cyclin A、cyclin E、CDK2、CDK4、c-Myc 蛋白（原癌基因c-Myc的表达产物）、pRb（视网膜母细胞瘤蛋白，是一种细胞周期抑制蛋白）、p-pRb（磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白）、PCNA（增殖细胞核抗原）结论：8e介导的G0/G1期的细胞周期停滞与周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21的上调和CDK2、CDK4、cyclin D1、cyclin A and cyclin E 的下调有关。35人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨Part 2 名词解释名词解释11.表皮生长因子

20、受体（EGFR）：一种可被胞外促有丝分裂因子（包括表皮生长因子、转化生长因子、双调蛋白和乙胞素）所激活的典型的酪氨酸蛋白激酶受体（RTK，245页）。很多癌细胞，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌等癌细胞都有EGFR过分表达的现象。2.雷帕霉素靶蛋白（mTOR）：广泛存在与各种细胞中，在细胞增殖、迁移、分化和生存中发挥重要作用，而且也是Akt（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）促进细胞生存和抑制细胞凋亡的下游靶标。同时mTOR也通过激活激酶P70S6K和抑制翻译起始因子eIF4E的抑制物4E-BP1来参与许多生存蛋白的起始翻译。36人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨名词解释名词解

21、释2PIK3：磷脂酰肌醇3激酶（254页），也就是磷脂酶C（PLC，237页），可以将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2，238页）水解为二脂酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。Akt：又称PKB（蛋白激酶B），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用。PI3K-Akt信号途径是一条经典的信号途径。ERK：细胞外信号调节激酶，是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的三大亚族之一，是哺乳类动物中了解的最为清楚的MAPK亚族，其信号传递通路为典型的MAPKKK/MAPKK/MAPK三级酶促级联反应，是调节细胞生长、发育以及分化的信号网络的核心。37人类结肠癌细胞

22、的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨名词解释名词解释3c-Src：是一种非受体酪氨酸蛋白激酶（即胞质酪氨酸蛋白激酶），其活化机制与受体酪氨酸蛋白激酶（RTKs）相似，同样需要自身磷酸化和受体二聚化。mTOR：雷帕霉素靶蛋白，通过与多种蛋 白结合成2种复合物 mTORC1和mTORC2 发挥其生理功能。STAT：信号传导及转录激活因子，可被特定的酪氨酸激酶（如c-Src）磷酸化为p-STAT，p-STAT发生聚合形成同源或异源二聚体活化态，进入核内与靶基因启动子序列的特定位点结合,促进其转录。已成功克隆4种JAK(JAK13和Tyk2)与7种STAT(STAT1，STAT2，STAT3，STAT4

23、，STAT5a，STAT5b，STAT6)。38人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨EGFR激活后有3条胞质信号通路：MAPK通路 PIK3通路 c-Src通路真核细胞内已发现的激活mTOR的信号通路：PI3K/AKT/mTOR Ras/MAPK/mTOR AMPK/mTOR（AMPK 是腺苷酸活化蛋白激酶）氧气/mTOR氨基酸/mTOR构成EGFR/mTOR信号通路39人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨12340人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨TSC1/2和Rheb是连接Akt和复合物mTOR1 的两个因子PI3K/AKT/mTOR信号通路41人类结

24、肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨 mTOR通过与多种蛋白结合形成两种复合物mTORC1和mTORC2发挥生理功能mTOR很重要的一条下游通路就是调控蛋白质的合成：在mTORC1的靶蛋白中，4E-BP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白）和p70S6K（核糖体蛋白S6激酶，254页）在控制蛋白质的合成方面起到重要作用。而mTORC1磷酸化4E-BP1和p70S6K。4E-BP1发生磷酸化后使elF4E（真核翻译起始因子4E）释放并活化，活化的elF4E启动mRNA 翻译，翻译产物含有与细胞周期相关的蛋白，细胞周期蛋白就在其中。p70S6K是真核生物核糖体 40S 小亚基S6蛋白（254页）

25、的激酶，活化的p70S6K使细胞内40S核糖体蛋白S6磷酸化，p-p70S6K 可促进mRNA的翻译。翻译产物主要是核糖体蛋白、翻译起始因子和翻译延伸因子等翻译装置的必需组分。42人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨mTOR在细胞生长、增殖过程中起重要作用，但是持续激活的PI3K/AKT/mTOR 信号与肿瘤的发生发展关系密切，它能加速细胞周期、减少细胞凋亡、并促进肿瘤细胞的迁移。胶质母细胞瘤中，RTKs/mTOR 通路（包括PI3K/AKT/mTOR和Ras/MAPK/mTOR这两条下游通路）发生异常的比例达88%。同时该通路的激活不但与肿瘤的形成相关，而且与肿瘤的恶性程度相关。

26、所以该通路成为靶向治疗肿瘤的研究热点。mTOR作为该通路下游重要的调节分子，是调节细胞周期进程和细胞生长的信号聚会点，无疑也成为肿瘤研究的热点。43人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨 8e 8e对对EGFR/mTOREGFR/mTOR信号转导通路的影响信号转导通路的影响44人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨因此，8e通过抑制EGFR/mTOR信号通路中多种信号传递因子的表达和活化，从而抑制癌细胞的增殖。45人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨文章结论文章结论总而言之，本研究探讨了一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物8e对体外和体内的人结肠癌细胞的抗增殖效力及

27、其分子机理。这是目前第一次报道化合物8e通过诱导G0/G1期的细胞周期停滞和抑制EGFR/mTOR信号通路从而有效抑制人结肠癌细胞的生长。而且，以小鼠为对象得到初步实验中没有观察到8e有明显的副作用。综上所述，化合物8e可能成为一种治疗人类结肠癌的新型药物。46人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨Antitumor effects of a novel benzonaphthofurandione derivative(8e)on the human colon cancer cells in vitro and in vivo through cell cycle arrest accompanied with the modulation of EGFR and mTOR signaling一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物（8e）通过调节表皮生长因子受体(EGFR)和调节雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号发送从而诱导细胞周期停滞进而对体外和体内的人结肠癌细胞产生抗癌作用细胞生物学20th47人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨