医药类大肠杆菌表达系统课件.ppt
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- 医药 大肠杆菌 表达 系统 课件
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1、外源基因在大肠杆菌中的表达2021/02/241外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物2021/02/242外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素2021/02/243外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因
2、在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数转录翻译2021/02/244P tac=3 P trp=11 P lac启动子2021/02/245 转录调控机理 具有多顺反子结构,基因排列次序为:启动子(lacP)-操纵基因(lacO)-结构基因(lacZ-lacY-lacA)正调节因子 CAP 负调节因子 lac I 启动子Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 2021/02/246 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY l
3、acARNA聚合酶基底水平转录Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活CAP,CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后,能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合,进而促进 Plac 介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型,即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP2021/02/247Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录,受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控,因此用它 构建的表
4、达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。2021/02/248Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下,lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白,与启动 子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA2021/02/249Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。调控模式与 lacUV5 相似,但 mRNA 转录水平更高于 trp
5、和 lacUV5 启动子(P tac=3 P trp=11 P lac),因此在要求有较高基因表达 水平的情况下,选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。2021/02/2410lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中,LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要。当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后,LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降,无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下,lacUV5、tac 启动子有较
6、高的本底转录。2021/02/2411lac、tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力,一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq,常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控,在使用高拷 贝复制子构建表达载体时,仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。2021/02/2412lac、tac 表达系统存在的问题 IPTG
7、 用于诱导 lac、tac 启动子的转录,但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度,对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录2021/02/2413lac、tac 表达系统存在的问题 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后,均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度
8、(30)时抑制,在较高温度(42)时开放。用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖,异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化,其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用,较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来,才能显示其良好的前景。2021/02/2414 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏,转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯
9、酸(IAA),便可有 效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中,除去色氨酸是困难的,因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达启动子Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 2021/02/2415Trp 表达系统 Ptrp OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效转录mRNA Ptrp Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶2021/02/2416PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL、PR 为核心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中,PL、PR 启动子转
10、录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。启动子2021/02/2417PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL、PR 启动子转录的 阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。因此 PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts)的基因产物 来调控 PL、PR 启动子的转录。在较低温度(30)时以活性形式存在 在较高温度(42)时失活脱落2021/02/2418PL 和 PR 表达系统 宿
11、主菌中没有 cI 基因产物,PL、PR 启动子的高强度直接转录,带有PL 或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。对宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌 N4830-1,POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts)l 噬菌体,可用作表达外源基因时的宿主菌。把 cI 857(ts)基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大2021/02/2419PL 和 PR 表达系统存在的问题 由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂,成本又低廉,最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。缺陷 在热
12、脉冲诱导过程中,大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活,其 中一些是蛋白水解酶,有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时,通过热平衡交换方式把培养温度从30 提高到 42 需要较长的时间,这种缓慢的升温方式影响诱导效 果,对重组蛋白表达量有一定的影响。2021/02/2420 T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系,利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。2021/02/2421 T7 表达系统 T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。T7 RNA 聚合酶活性高,其合成 RNA 的速
13、度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下,大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系,最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。2021/02/2422T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶,因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统T7 RNA 聚合酶T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因?启动子2021/02/2423
14、 T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株,一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌,调控方式为 化学诱导型,类似于 Lac 表达 系统。T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子E.Coli(DE3)T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG诱导2021/02/2424 T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因,通过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转
15、录降到 很低的水平,尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质。T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子E.Coli(CE6)T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶热诱导cI8572021/02/2425 T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因,另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同 调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型T7 RNA 聚合酶热诱导T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpR2021
16、/02/2426T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的,但 也不可避免出现在相对较高的本底转录,如果目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性,会影响细胞的生长。解决办法之一 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因。因为 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外,还能与 T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。目前 T7 溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统,它能明显 降低本底转录,但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。2021/02/2427 营养调控型 采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因 phoA 启动子或甘油 3-磷酸转移系 统 ugp 启动
17、子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷(Pi)浓度调控(Pi5mmol/L 时抑制,Pi1mmol/L 时激活),具有较高的转录水平。2021/02/2428 糖原调控型 采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统(mglBAEC)mgl 启动子或沙门 氏菌阿拉伯糖基因 araB 启动子构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制,岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于 Lac 表达系统.其他表达系统2021/02/2429 pH调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。cadA 启动子受培养基中 H+浓度,即 pH 值调控。(在pH8 时抑 制,pH 6时激活,p
18、H=6时转录活力最高)。该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 30 之间才能使目的基 因得到稳定的表达.其他表达系统2021/02/2430溶氧调控型 采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子,硝基还原酶基 因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子构建表达载 体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子 fnr 的作用位点。在富氧条件下转录被抑制,在贫氧或微氧条件下转录被激活。2021/02/2431溶氧调控型 大肠杆菌 GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)启动子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表达质粒,vgb 基因的转录是受环境溶氧 浓度调控的,在贫氧条件下
19、 vgb 基因的启动子被激活。因此,用大肠杆菌GJ100 作为宿主时,表达系统调控方式为贫氧 诱导型,菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量 加以调节,与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。2021/02/2432生物素调控型 用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体,菌体生长过程 中生物素会不断消耗,当浓度到达 2ng/ml 以下时启动子被激活。能够在没有外界的物理,化学信号的介入条件下自动诱导表达目的 基因是这类表达载体的特点,其缺陷是不容易精确控制自动诱导的 时刻。2021/02/2433强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即 R
20、NA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列,形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下:转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加,外源基 因本身的转录效率下降;如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域,如选择性标 记基因和复制子结构等,则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性;过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗;更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外 源基因编码产物
21、的翻译效率终止子2021/02/2434强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。对于一些终止作用较弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构,以增强其转录终止作用终止子2021/02/2435核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率,而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定,称为
22、核糖体结合位点(RBS)核糖体结合位点2021/02/2436核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素:位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上,从而启动翻译;翻译起始密码子,大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点,有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子
23、的碱基序列核糖体结合位点2021/02/2437核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 一般来说,mRNA 与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效率就 越高,而这种结合程度主要取决于 SD(UAAGGAGG)序列与 16S rRNA 的碱基互补性,其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言,上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T,均会导 致翻译效率大幅度降低核糖体结合位点2021/02/2438核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的序列的影响 SD 序列下游的碱基若为 AAAA 或 UUUU,翻译效率最高;而 CCCC 或 GGGG 的翻译效率
24、则分别是最高值的 50%和 25%。紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言,在这个位置上最佳 的碱基组合是 UAU 或 CUU,如果用 UUC、UCA 或 AGG 取代 之,则酶的表达水平低 20 倍核糖体结合位点2021/02/2439核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的精确距离保证了 mRNA 在 核糖体上定位后,翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物 结构中的 P 位,这是翻译启动的前提条件。在很多情况下,SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处
25、,在此 间隔中少一个碱基或多一个碱基,均会导致翻译起始效率不同 程度的降低核糖体结合位点2021/02/2440核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG 三种起始密码子,但其识别频率并不相同,通常 GUG 为 AUG 的 50%,而 UUG 只及 AUG 的 25%。除此之外,从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要,至 少这一序列不能与 mRNA 的 5 端非编码区形成茎环结构,否则便 会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含
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