无菌检查法专业医学知识宣讲培训课件.ppt

1、无菌检查法专业医学知识宣讲无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染2无菌检查法专业医学知识宣讲环境洁净度2010版无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度 10 000 10 000级下的局部洁级下的局部洁净度净度 100 100级的单向流空气区域内或隔离系统中进级的单向流空气区域内或隔离系统中进行行2015版无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生

2、物的检出。3无菌检查法专业医学知识宣讲培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。制备好的培养基应保存在 225、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在 3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。4无菌检查法专业医学知识宣讲培养基PH区别2010版2015版改良马丁培养基调节 pH 值使灭菌后为 6.4 0.2胰酪大豆胨液体培养基调节 pH 使灭菌后pH值为 7.30.2营养肉汤培养基调节 pH 值使灭菌后为 7.2 0.2胰酪大豆胨琼脂培养基 调节 pH使灭菌后在 25的pH 值为 7.30.2 营养琼脂培养基调

3、节pH 值使灭菌后为 7.20.2沙氏葡萄糖液体培养基调节 pH使灭菌后在 25的pH 值为 5.60.2改良马丁琼脂培养基调节 pH值使灭菌后为 6.40.2沙氏葡萄糖琼脂培养基调节 pH使灭菌后在25的pH值为5.60.25无菌检查法专业医学知识宣讲培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。无菌性检查无菌性检查 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养 14天，应无菌生长。6无菌检查法专业医学知识宣讲培养基的适用性检查 灵敏度检查灵敏

4、度检查菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨胰酪大豆胨液体培养基中或胰液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养酪大豆胨琼脂培养基基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏沙氏葡萄糖液体培养基葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼中或沙氏葡萄糖琼脂培脂培养基养基上，20202525培养培养 242448 48 小时小时，上述培养物用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养 物至沙氏葡萄糖

5、琼脂斜沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上面培养基上，20202525培养培养 5 57 7 天天，加入 35ml 含 0.05（v/v）聚山梨酯 80 的 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05（v/v）聚山梨酯 80的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数小于 100cfu 的孢子悬液。7无菌检查法专业医学知识宣讲培养基的适用性检查 培养基接种培养基接种 取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 7 7 支，分别接种小于 100cfu 的金黄色葡萄球

6、菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各 2支，另 1支不接种作为空白对照，培养 3 天；取每管装量为 9ml 的胰酪大豆胨液体胰酪大豆胨液体培养基培养基 7 7支,分别接种小于 100cfu的枯草枯草芽孢杆菌芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空白对照，培养 5天。逐日观察结果。9无菌检查法专业医学知识宣讲培养基接种直观区别2010版2015版硫乙醇酸盐流体培养基9支金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基7支金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌改良马丁培养基5支白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基7支枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉10无菌检查法

7、专业医学知识宣讲方法适用性试验菌种及菌液制备菌种及菌液制备 除大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B)44102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培 养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。11无菌检查法专业医学知识宣讲方法适用性试验薄膜过滤法薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于 100cfu的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体胰酪大豆胨液体培养基培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养 3 35 5 天，各试

8、验菌同法操作。12无菌检查法专业医学知识宣讲方法适用性试验结果判断结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。13无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌

9、检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明有效性，且对微生物无毒性。14无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查检验数量检验数量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量检验量检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g 或ml）。15无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查阳性对照阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭生

10、孢梭菌菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念白色念珠菌珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于加菌量小于 100cfu100cfu，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养 484872 72 小时小时应生长良好。阴性对照阴性对照 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。16无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查薄膜过滤法薄膜过滤法 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m。直径约为 50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后

11、的完整性。水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为 100ml，且总冲洗量不得超过 1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。17无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查水溶液供试品水溶液供试品 取规定量，直接过滤，或混合至含不少于 100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。除

12、生物制品外，一般样品冲洗后，1 1份份滤器加入滤器加入 100ml100ml硫乙醇酸盐流体培养基，硫乙醇酸盐流体培养基，1 1份滤器加入份滤器加入 100ml100ml胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基。18无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查培养及观察培养及观察 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养 14天；一份置 3035培养，一份置 2025培养。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养 14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养培养 3 3 天天，观察接种的同

13、种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。19无菌检查法专业医学知识宣讲培养及观察直观区别2010版2015版培养 14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养细菌培养 2 2天、天、真菌培养真菌培养 3 3天天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊培养 14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养培养 3 3 天天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊20无菌检查法专业医学知识宣讲供试品的无菌检查结果判断结果判断 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效

14、。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。21无菌检查法专业医学知识宣讲 谢谢！22无菌检查法专业医学知识宣讲