狂犬病疫苗治疗抗体及其诊断新版课件.pptx

1、需要在P3实验室中操作，并需要有经验的技术员。耗时较长，不适于作快速诊断用。（20世纪8090年代）浓缩疫苗 2.待检人血清中的抗狂犬病毒抗体WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.国外产品 50 8.但是保留在机体组织内的病毒加温灭活的时间要延长些。17年间 伊朗 364 疫苗抗血清 19 5.人数 平均效价 阳转率狂犬病疫苗临床反应观察结果0%3.武汉生物制品研究所徐葛林等采用多种抗狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体混合物标记荧光素，经法国巴斯德研究所多次实验，分别检测了人、犬、猫、狐狸、臭鼬、蝙蝠等12种动物来源的样品，包括目前已知的狂犬病毒7个基因型在内的共计360多份样品，与BIO-RAD同

2、类产品相比，证实我国制备的荧光抗体具有非特异性小、灵敏度高、使用前不需用正常鼠脑吸附的特点，得到国外同行的认可。8 IU/ml 215 单用疫苗 3 60引起过敏反应的血清成分武汉生物制品研究所用抗狂犬病毒核蛋白的单抗建立了用于检测狂犬病毒抗原的双抗体夹心ELISA法，目前经与小鼠颅内接种及FAT法相比较，检测了近1000份动物脑组织，结果完全一致，该试剂盒对基因1型的狂犬病毒检出灵敏度达到0.武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗NON NERVOUS TISSUES(MUSCLE CELLS)PERIPHERAL NERVOUS SYSTEMCENTRAL NERVOUS SYSTEMDEATH

3、AXOPLASMIC FLOW RECEPT ORS?NON NERV OUSTISSUES(SALIVA RYGLANDS)AXOPLASMIC FLOW 3040的狂犬病患者病程晚期脑部大量增生的狂犬病毒突破血脑屏障进入血液，诱导产生极高水平的狂犬病毒抗体，一般高出疫苗诱导抗体水平的100倍，对于不典型症状的狂犬病病例可通过这一指标作实验室确证。微生物学免疫学进展 2000年 28(1):10-11武生旺宁免疫动物街毒攻击保护性试验颅内接种10-12克小白鼠03003INDOFL20021006 3.特异性 99.WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.中国药典狂犬病疫苗规程但是保留在机体

4、组织内的病毒加温灭活的时间要延长些。20021109 3.1、狂犬病毒抗原的检测与诊断(Diagnostic procedures for antigen detection)含有狂犬病毒的脑组织在常温下可保存活力7-10天，在日光和紫外线照射下，或强酸、强碱的环境下，病毒灭活的时间会缩短。狂犬病毒一般是通过破损的皮肤或黏膜进入人体的。20021210 2.在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。脑或神经组织的印片、涂片或冰冻切片经过标记有异硫氰酸荧光素的狂犬病毒抗血清或球蛋白处理后，在紫外线激发下，通过荧光显微镜即可检测，狂犬病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒，

5、呈不同的形状和大小，较大的圆形或椭圆形发强烈荧光者为内基氏小体（Negri bodies)，而象沙粒或灰尘的较细小的荧光粒子及丝状荧光物为神经元或树突中含有的狂犬病毒颗粒，荧光颗粒大小范围为0.超滤、分子筛层析纯化精制并灭活狂犬病毒一般是通过破损的皮肤或黏膜进入人体的。原理：将预先滴定致细胞80感染的攻击毒株CVS与3倍系列稀释的待滴定血清37C孵育1小时，试验中设包括已知中和抗体国际单位含量的参照血清，再将血清/病毒混和液加入BSR细胞悬液。一旦狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑和脊髓的神经细胞，并大量增生，则引起神经细胞功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状，一旦发病，目前尚无法医治，病死率为1

6、00。狂犬病毒在脑神经细胞中大量增生后，通过传出神经离心性地向外扩散到周围神经及其所支配的组织中，从而引起广泛的非神经组织的感染，常累积于唾液腺，病毒大量增生而由唾液腺排除体外，一般出现典型的狂犬病症状后一周内死亡。WHOWHO推荐的暴露后治疗指南推荐的暴露后治疗指南狂犬病发病与抗体消长趋势狂犬病发病与抗体消长趋势疫苗注射疫苗注射0天天7天天14天天180天天360天天自主抗体低水平期自主抗体低水平期3天天28天天体内自主抗体水平体内自主抗体水平发病率发病率4343天天103103天天体内被动免疫抗体水平体内被动免疫抗体水平被动免疫被动免疫 使用年代使用年代 制备来源制备来源 效力效力 注射次

7、数注射次数第一代狂犬病疫苗第一代狂犬病疫苗 羊脑组织疫苗羊脑组织疫苗 0.8 IU/ml 21（20世纪世纪6070年代）年代）第二代狂犬病疫苗第二代狂犬病疫苗 地鼠肾细胞疫苗地鼠肾细胞疫苗 原倍疫苗原倍疫苗 1.3 IU/ml5（20世纪世纪8090年代）年代）浓缩疫苗浓缩疫苗 2.5 IU/ml 5 第三代狂犬病疫苗第三代狂犬病疫苗 Vero细胞纯化疫苗细胞纯化疫苗 2.5 IU/ml 5（21世纪）世纪）0.19911CBG9908CBG9916CBG9719cCAMB02006CBGGX9912CBGGX01017VNMGX01016VNM8743THA8734THA8758cTHA8

8、760cTHA8738THA8664cTHAI020059910LAO02002LAO02001LAOGX9914CBGGX9915BIRGX9909BIR9913BIRGX8677cMAL02042CHIGX02041CHIGX02045CHIGX02043CHIGX02044CHI02040CHIGX9811CHI02035CHI02036CHI02037CHI03003INDOFL9707CHIGX02050CHIFL94270PHI94280PHIGX94273PHIGX03007PHI03006PHI02047CHIGX02049CHIGX02046CHI9709cCHI9702IN

9、DI94257cSRI9903NEPGX9902NEP9901NEP94260cNEP020529706CHIGX8690CHIGXRCHLCVSPVaGCTN亚洲街毒分离株亚洲街毒分离株N基因序列进化图基因序列进化图中国街毒1组中国街毒3组中国街毒2组中国街毒4组街毒街毒3组组街毒街毒2 2组组街毒街毒4 4组组街毒街毒1 1组组C，10分钟即可灭活。但是保留在机体组织内的病毒加温灭活的时间要延长些。20020905 2.在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。上世纪70年代中期以来，各实验室相继用婴地鼠肾细胞、BHK21、鸡胚细胞、成神经瘤细胞分离街毒狂犬病毒。19

10、73年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。4 14.滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。5IU/ml，必须给予加强剂量，直到抗体达到要求的水平。该方法为WHO推荐的狂犬病中和抗体首选滴定法，武汉生物制品研究所已从法国成功引进此法，所用荧光抗体已完全达到国产化。武生旺宁免疫动物街毒攻击保护性试验我国药典规定,狂犬病疫苗NIH效力必须达到 2.滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。耗时较短，可用于精确定量的快速诊断；2002100

11、6 3.00 20030307 3.观察并记录小鼠发病及死亡情况人数 平均效价 阳转率精制马抗狂犬血清柱层析纯化示意图28%7.（）0 29.5国际单位（IU）/ml的抗体水平才具有足够的保护性，如果滴度低于0.武生旺宁精制苗的纯度纯化后去除了9598的杂蛋白残余牛血清含量50ng/ml05101520253035副反应发生率（%）全身反应局部反应武生旺宁武生旺宁国外产品国外产品国内产品国内产品狂犬病疫苗临床反应观察结果狂犬病疫苗临床反应观察结果武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗中国国家标准品的制备中国国家标准品的制备99%ND脑组织需要预先用含1050灭活牛血清

12、的生理盐水或PBS或脱脂奶研磨成10悬液，150200g离心5分钟去除粗颗粒；NE1 20040102-01 0.37中和1小时 复滴定FFU国外产品 50 8.1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。（20世纪8090年代）浓缩疫苗 2.以提纯的狂犬病毒核衣壳免疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克隆抗体与异硫氰酸荧光素偶联后，用直接免疫荧光法可特异地与这些包涵体结合，该方法是狂犬病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。该方法由Perrin.病例数 0 464 846 226 1920

13、020201 3.俞永新等狂犬病和狂犬病疫苗中国医药科技出版社 2001年 p190-191触摸或饲养动物 舔在完整皮肤上在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。病毒运行、扩散过程的长短与潜伏期有关，一般为20-60天或更长或更短，这与病毒侵入部位和数量有关，在此过程中，若对机体进行疫苗接种，提高机体的抗感染能力，则可预防发病。36 20030206 2.NE1 20040102-01 0.人狂犬病免疫球蛋白使用量为20 IU/KG体重,马抗狂犬病血清使用剂量为40 IU/KG体重。NE4 20031234 0.1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有

14、小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。轻度抓伤或擦伤但未出血武汉生物制品研究所用抗狂犬病毒核蛋白的单抗建立了用于检测狂犬病毒抗原的双抗体夹心ELISA法，目前经与小鼠颅内接种及FAT法相比较，检测了近1000份动物脑组织，结果完全一致，该试剂盒对基因1型的狂犬病毒检出灵敏度达到0.武汉生物制品研究所起草武汉生物制品研究所起草中国药典中国药典狂犬病疫苗规程狂犬病疫苗规程引起过敏反应引起过敏反应的血清成分的血清成分具有中和活性具有中和活性的血清成分的血清成分尼氏小体大多出现在海马回、大脑皮质的锥体细胞和浦肯也氏细胞中，较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和

15、感觉神经节等神经组织中，因此在进行神经组织为标本的实验室诊断中，其标本的选择就显得尤为重要。C，10分钟即可灭活。该方法由Perrin.03003INDOFL以提纯的狂犬病毒核衣壳免疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克隆抗体与异硫氰酸荧光素偶联后，用直接免疫荧光法可特异地与这些包涵体结合，该方法是狂犬病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。狂犬病组织培养感染实验(rabie tissue-culture infection test RTCIT)敏感性 99.NE1 20040102-01 0.武汉生物制品研究所承担狂犬病疫苗2%狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml)28%7.36

16、20030206 2.1ml的N2a细胞悬液（5105细胞/ml）于96孔微量细胞培养板孔中，37C 5 CO2孵箱中培养24小时，甩出培养液，板孔用80冷丙酮室温固定30分钟，甩干，晾干后加入荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白的抗体，37C孵育45分钟,PBS洗涤即可通过荧光显微镜观察。03003INDOFL狂犬病毒从侵入局部进入周围神经组织内，沿着神经向心传递至中枢神经系统。狂犬病毒从侵入局部进入周围神经组织内，沿着神经向心传递至中枢神经系统。特异性 99.0%3.狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原的检查。诊断技术 免疫荧光 快速酶 小鼠颅内 细胞培养 胶体金

17、狂犬病毒抗原荧光标记抗狂犬病毒抗体抗狂犬病毒单抗狂犬病毒样品酶标抗狂犬病毒抗体NE1 20040102-01 0.0%3.（设已知国际单位的标准血清对照）CVS鼠脑悬液（稀释成30-300LD50）21 20030309 3.只能一次注射,不应多次注射。荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。RREID可通过检测脑组织中的狂犬病毒核衣壳来诊断狂犬病。（设已知国际单位的标准血清对照）CVS病毒悬液（致80细胞感染的病毒量）28 单用疫苗 11 39.20021006 3.国外产品 50 8.国内外抗狂犬病血清临床使用效果21 20030309 3.待检

18、人血清中的抗狂犬病毒抗体酶免疫吸附法（ELISA）：1%胰蛋白酶等也可使病毒灭活。狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml)狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原的检查。引起过敏反应的血清成分50 IU/ml 以上方为合格NE1 20040102-01 0.30%脑悬液样品，5000rmp，5minN2a细胞，继续培养24h后固定，加荧光标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体细胞无荧光，表明样品中不含狂犬病毒细胞有荧光，表明样品中含有狂犬病毒第一代狂犬病疫苗 羊脑组织疫苗 0.引起过敏反应的血清成分在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。（）0 29.

19、36 20030206 2.20021210 2.武生旺宁 20040202 2.该方法所能检测到的基因1型狂犬病毒最小核衣壳抗原量为0.96%ND 99.在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml)20020905 2.28 单用疫苗 11 39.国内产品 50 34.如用1-3日龄的乳鼠，可提高分离病毒的阳性率。俞永新等狂犬病和狂犬病疫苗中国医药科技出版社 2001年 p190-191该方法由Perrin.耗时较短，可用于精确定量的快速诊断；1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试

20、验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。但是保留在机体组织内的病毒加温灭活的时间要延长些。E 20031202.50 IU/ml 以上方为合格国内外抗狂犬病血清临床使用效果89 20030410 2.武生旺宁 20040202 2.一旦狂犬病毒进入中枢神经，侵犯脑和脊髓的神经细胞，并大量增生，则引起神经细胞功能紊乱和退行性病变，机体开始出现症状，一旦发病，目前尚无法医治，病死率为100。20021007 5.狂犬病组织培养感染实验(rabie tissue-culture infection test RTCIT)狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗

21、原的检查。92 20030205 3.1、狂犬病毒抗原的检测与诊断(Diagnostic procedures for antigen detection)仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒，需配合免疫荧光法作特异性鉴定。狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml)1982 3 单用疫苗 3 10000 20030307 3.1:5 肌肉攻击 10 10 100国内产品 50 34.0%3.在欧美国家暴露后无论伤口轻重程度，均联合使用狂犬病疫苗和抗血清。武生旺宁 304 4.99%ND 抗狂犬病毒单抗包被 狂犬病毒抗原待检人血清中的抗狂犬病毒抗体酶标抗人IgG抗体显色底物方法 MNTRFFITE

22、LISAIFA时间 21天26小时4小时2小时定性或 定量定量 定量 定性定量NON NERVOUS TISSUES(MUSCLE CELLS)PERIPHERAL NERVOUS SYSTEMCENTRAL NERVOUS SYSTEMDEATHAXOPLASMIC FLOW RECEPT ORS?NON NERV OUSTISSUES(SALIVA RYGLANDS)AXOPLASMIC FLOW 引起过敏反应引起过敏反应的血清成分的血清成分具有中和活性具有中和活性的血清成分的血清成分以提纯的狂犬病毒核衣壳免疫实验动物制备的多克隆抗体，或抗核衣壳单克隆抗体与异硫氰酸荧光素偶联后，用直接免疫

23、荧光法可特异地与这些包涵体结合，该方法是狂犬病毒实验室诊断最精确、快速和最可靠的方法。5 单用疫苗 3 601982 3 单用疫苗 3 100敏感性 99.立即接种狂犬病疫苗及免疫球白国内产品 50 34.-苏联 22 疫苗抗血清 0 0狂犬病毒是嗜神经性病毒，可采用颅内接种法分离后，再进行狂犬病特异性抗原的检查。微生物学免疫学进展 2000年 28(1):10-11原倍 颅内攻击 10 10 1005IU/ml，必须给予加强剂量，直到抗体达到要求的水平。实验周期需14天，耗时长，不利于快速诊断；28 单用疫苗 11 39.狂犬病疫苗品种 批号 效力(IU/ml)该方法所能检测到的基因1型狂犬病毒最小核衣壳抗原量为0.时间 地点 肇事动物 重伤人数 处理 死亡人数 死亡率E 20031202.24%11.狂 犬 病 的 传 染 源俞永新等狂犬病和狂犬病疫苗中国医药科技出版社 2001年 p190-191