DNA电泳及应用技术精美生物医学课件.ppt
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1、DNA电泳及应用技术电泳及应用技术找答案基因操作中常用电泳有哪些?差别在哪里?影响凝胶电泳的 因素有哪些?聚丙烯酰胺凝胶是怎么样构成的?电泳:是指电泳:是指带电粒子带电粒子在电场中向与其自身在电场中向与其自身 带相反电荷的电极移动的现象。带相反电荷的电极移动的现象。概 述凝胶电泳:由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺凝胶电泳:由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺 等物质作支持体的电泳。等物质作支持体的电泳。特点:特点:1.1.可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中泳动。泳动。2.2.电泳操作方法简便,电泳速度快电泳操作方法简便,电泳速度快3.3.分
2、辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。分辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。4.4.适用于生化,免疫等定性定量测定适用于生化,免疫等定性定量测定 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶天然琼脂(天然琼脂(agaragar):又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。高聚物。琼脂糖(琼脂糖(agaroseagarose)琼脂胶(琼脂胶(agaropectinagaropectin)琼脂糖琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔带电荷可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔
3、径的大小决定于径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶的特点(一)优点(一)优点1.1.分离范围广,约分离范围广,约200bp50kb200bp50kb的核酸均可。的核酸均可。3.3.凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的复合凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的复合物、核酸、病毒物、核酸、病毒 等大分子物质。等大分子物质。4.4.透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量测定测定6.6.有热可逆性有热可逆性(二)缺点(二)缺点1.1.机械强度差机械强
4、度差,易破碎,浓度不能太低。,易破碎,浓度不能太低。2.2.易被细菌污染易被细菌污染,不易保存,临用前配制。,不易保存,临用前配制。3.3.琼脂糖支持层上的琼脂糖支持层上的区带易于扩散区带易于扩散,电泳后,电泳后必须立即固定染色。必须立即固定染色。4.4.与聚丙烯酰胺电泳相比,与聚丙烯酰胺电泳相比,分辨率低分辨率低。影响核酸凝胶电泳的因素:影响核酸凝胶电泳的因素:1样品核酸的性质样品核酸的性质 2电场强度和电场方向电场强度和电场方向3电泳环境:缓冲液的组成和离子强度直接电泳环境:缓冲液的组成和离子强度直接 影响迁移率影响迁移率4凝胶孔径的大小凝胶孔径的大小。什么是迁移率带电颗粒在单位电场强度下
5、的泳动速度带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度影响因素有:影响因素有:1、DNA的分子大小的分子大小线状双链线状双链DNA分子在一定浓度分子在一定浓度琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶中中的迁移速率与的迁移速率与DNA分子量对数分子量对数成成反比反比分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度琼脂糖浓度DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。系。v 配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的 DNA分子大小分子大小来确定。来确定。琼脂糖凝
6、胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围 3、DNA分子的构象分子的构象相同分子量的线状、开环和超螺旋相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼在琼脂糖凝胶中移动速度脂糖凝胶中移动速度超螺旋超螺旋DNA最快最快,而而开环开环双链双链DNA移动最慢。移动最慢。4、电源电压电源电压在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加片段的迁移速率与所加电压成正比。电压成正比。随着随着电场强度的增加电场强度的增加,片段越大,片段越大,因场强升高因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大琼脂糖凝胶的引起的迁移率升高幅度也越大琼脂糖凝胶的有效有效分离范围将缩小分离范围将缩小。5、嵌入染料的存在
7、、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶(荧光染料溴化乙啶(EB)用于检测琼脂糖凝胶中的)用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间,使线状染料会嵌入到堆积的碱基对之间,使线状DNA迁移率降低迁移率降低15。常用染料常用染料EB:EB:溴化乙锭,溴化乙锭,能插入能插入DNADNA分子碱基对之间,分子碱基对之间,导致导致EBEB与与DNADNA结合。结合。DNADNA吸收的吸收的260nm260nm的紫外光传递给的紫外光传递给EBEB,或者结合的,或者结合的EBEB本身在本身在300300和和360360吸收的射线,均可在可见光区吸收的射线,均可在可见光区以以590590波长发射出来,呈
8、橙红色。波长发射出来,呈橙红色。优点:染色操作简便,快速,室温下优点:染色操作简便,快速,室温下15-20min15-20min;不会使核酸断裂;灵敏度高,不会使核酸断裂;灵敏度高,10ng10ng或更少的或更少的DNADNA即可检出;可以加到样品中。即可检出;可以加到样品中。EBEB是诱变剂,使用时一定要戴手套。是诱变剂,使用时一定要戴手套。EB EB废液要废液要经过处理才能丢弃。经过处理才能丢弃。SYBR:SYBR:新型低毒,高灵敏度染料,加入样新型低毒,高灵敏度染料,加入样 品品中,价格较昂贵。中,价格较昂贵。Gene finder:Gene finder:新型低毒,高灵敏度染料,加新型
9、低毒,高灵敏度染料,加入样胶中,价格较低。入样胶中,价格较低。6、离子强度影响离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的的电泳迁移率。电泳迁移率。没有离子存在时没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶如误用蒸馏水配制凝胶),电电导率导率最小最小,DNA几乎不移动几乎不移动在高离子强度的在高离子强度的缓冲液缓冲液中中(如误加如误加10电泳缓电泳缓冲液冲液),严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。变性。常用的电泳缓冲液常用的电泳缓冲液一般配制成浓缩母液一般配制成浓缩母液,储于储于4 保存备用保存备用.实验步骤实验步骤 1g 1g 琼脂糖加入琼
10、脂糖加入100ml 1100ml 1TAETAE电泳缓电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。脂糖完全溶解。(冷却到(冷却到6060,加入,加入100l100l的的0.5mg/ml 0.5mg/ml EBEB,并摇匀。),并摇匀。)用胶带将制胶板两端封好,用胶带将制胶板两端封好,插入适当插入适当梳子梳子,将溶解的琼脂糖(约,将溶解的琼脂糖(约5050)倒入,)倒入,室温冷却凝固。室温冷却凝固。充分凝固后撕掉两端的胶布,将充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加凝胶置入电泳槽中,加1 1TAETAE电电泳缓冲液至液面覆盖凝胶泳缓冲液至液面覆盖凝
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