流式细胞仪医学知识培训课件.ppt

1、流式细胞仪医学知识流式细胞仪医学知识流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）是一种可）是一种可以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。其中用到的流式细胞仪（分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧

2、光化学技术、单克隆、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（Fluorescence-Activated Cell Sorting,FACS），所），所以目前大多数流式细胞仪机型都以以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。命名。2流式细胞仪医学知识流式细胞术的基本概念流式细胞术（F l o w C y t o me t r y分流式细胞术的基本特点分流式细胞术的基本特点v分析对象：单细胞悬液或生物微粒；v分析速度：快速，可高达104

3、个细胞/秒；v检测参数：多参数（散射光参数、荧光参数）；v可同时检测多种可溶性成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads Array,CBA）v强大的细胞分选功能：在分析的同时可以对特定群体加以分选。3流式细胞仪医学知识分流式细胞术的基本特点3 流式细胞仪医学知识细胞结构：包括细胞的大小、颗粒度、表面积、DNA含量及细胞周期和RNA的含量等。细胞功能：细胞表面或胞浆、核内的特异性抗原、细胞因子、受体；蛋白磷酸化、pH值及细胞钙例子浓度等。流式细胞术的检测范围流式细胞术的检测范围4流式细胞仪医学知识细胞结构：包括细胞的大小、颗粒度、表面积、D N A 含量及细胞周流式细胞术的优势流

4、式细胞术的优势目前有多种方法能够检测蛋白的表达，如免疫印目前有多种方法能够检测蛋白的表达，如免疫印迹、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学以及免疫荧迹、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学以及免疫荧光等。它们与流式细胞术相比各有侧重。光等。它们与流式细胞术相比各有侧重。流式细胞术：流式细胞术：能快速（可达能快速（可达104细胞细胞/秒）、定位秒）、定位（胞膜或胞浆）、定量（细胞的相对或绝对计数、（胞膜或胞浆）、定量（细胞的相对或绝对计数、蛋白的表达水平）并且高灵敏度和高特异性地检测蛋白的表达水平）并且高灵敏度和高特异性地检测多种活性蛋白的共表达情况，同时也是一项可以把多种活性蛋白的共表达情况，同时也是一项

5、可以把具有相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群具有相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。因此与上述体中分离和富集出来的细胞分析技术。因此与上述多种生物检测方法相比有明显的优势。多种生物检测方法相比有明显的优势。5流式细胞仪医学知识流式细胞术的优势目前有多种方法能够检测蛋白的表达，如免疫印酶联免疫吸附测定：酶联免疫吸附测定：定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，不能体现细胞或组织定位以及多种蛋白的共表达情况。灵敏不能体现细胞或组织定位以及多种蛋白的共表达情况。灵敏度高，特异性低。度高，特异性低。免疫组织化学：免疫组织化学：能直

6、观的定位蛋白在组织中的分布，不能定能直观的定位蛋白在组织中的分布，不能定量。操作步骤多，灵敏度低，假阳性率高。量。操作步骤多，灵敏度低，假阳性率高。免疫荧光：免疫荧光：能直观体现蛋白的亚细胞定位，相对定量，不能能直观体现蛋白的亚细胞定位，相对定量，不能同时大量检测多种不同蛋白的共表达。同时大量检测多种不同蛋白的共表达。免疫印迹：免疫印迹：定性、相对定量检测细胞或组织液中蛋白的表达定性、相对定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，不能代表蛋白的天然状态、细胞或组织定位以及两种以上，不能代表蛋白的天然状态、细胞或组织定位以及两种以上蛋白的共表达情况。操作繁琐，灵敏度低。蛋白的共表达情况。操作繁琐，灵敏度

7、低。6流式细胞仪医学知识酶联免疫吸附测定：定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，不能体现流式细胞检测样本的制备：流式细胞检测样本的制备：细胞样本的处理：细胞样本的处理：组织样本的处理组织样本的处理流式细胞仪检测的信号：流式细胞仪检测的信号：散射光信号：前向角散射光（散射光信号：前向角散射光（Forward scatterForward scatter，FSC)FSC)与细胞大小有关；侧向角散射与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter(Side scatter，SSCSSC，又，又称称9090角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、

8、核膜变化更敏感。胞膜、胞质、核膜变化更敏感。荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号；结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号；自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发发 荧光（荧光信号产生于他们自身）。荧光（荧光信号产生于他们自身）。7流式细胞仪医学知识流式细胞检测样本的制备：7 流式细胞仪医学知识流式细胞术的常用试剂：流式细胞术的常用试剂：荧光染料

9、：荧光染料也称荧光素，根据其应用的领域不同主要分为核酸染料和荧光染料：荧光染料也称荧光素，根据其应用的领域不同主要分为核酸染料和蛋白染料。蛋白染料。1.核酸染料：是指能与核酸染料：是指能与DNA或与或与RNA结合的染料，它们在激光器激发的发射光结合的染料，它们在激光器激发的发射光能被检测器收集，主要用于检测核酸含量以及细胞周期，也可以与荧光染料两能被检测器收集，主要用于检测核酸含量以及细胞周期，也可以与荧光染料两河应用，判断细胞的生物学活性。常用的有碘化丙啶（河应用，判断细胞的生物学活性。常用的有碘化丙啶（Propidine Iodide,PI）、DAPI及及7-氨基放线菌素氨基放线菌素D（7

10、-Aminoactinomycin D，7-AAD）等。）等。2.蛋白染料：蛋白染料有多种，大多数是与蛋白中的某些氨基酸基团形成稳定蛋白染料：蛋白染料有多种，大多数是与蛋白中的某些氨基酸基团形成稳定的结合，如的结合，如CFSE是最常用的活细胞染料，也称是最常用的活细胞染料，也称CFDA-SE或或CFDA，它与胞内，它与胞内蛋白赖氨酸侧链及可利用的氨基发生不可逆结合，随着细胞分裂而被减，广泛蛋白赖氨酸侧链及可利用的氨基发生不可逆结合，随着细胞分裂而被减，广泛用于细胞体外增殖或是体内示踪等。除此之外，蛋白染料更为广泛的用途在于用于细胞体外增殖或是体内示踪等。除此之外，蛋白染料更为广泛的用途在于标记

11、生物大分子，其中主要是抗体。这些抗体与染料结合以后，形成荧光抗体标记生物大分子，其中主要是抗体。这些抗体与染料结合以后，形成荧光抗体，与细胞表面或是胞浆中的抗原特异性结合后，经流式细胞仪检测，从而反映，与细胞表面或是胞浆中的抗原特异性结合后，经流式细胞仪检测，从而反映抗原的表达及分布情况。抗原的表达及分布情况。这类染料主要有异硫氰酸荧光素（这类染料主要有异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）、藻红）、藻红蛋白（蛋白（Phycoerythrin，PE or R-PE）、别藻红蛋白（）、别藻红蛋白（Allophycocyanin，APC）、多甲藻叶绿素蛋白

12、（）、多甲藻叶绿素蛋白（Peridinin chlorophyll protein，PerCP）等等，目前世）等等，目前世界上最大的荧光染料生产商当属界上最大的荧光染料生产商当属Invitrogen旗下旗下Molecular Probes公司。公司。8流式细胞仪医学知识流式细胞术的常用试剂：8 流式细胞仪医学知识常用荧光染料的特性常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(nm)发射波长(nm)用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1)488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色

13、橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 6709流式细胞仪医学知识常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长(n m)发5 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC710流式细胞仪医学知识5 C o l o r S i n g l e L a s e r (4 8 8 n m)F流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理l 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；性与激发效率；l 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术利用荧光染料与单克隆抗体技术结

14、合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；，保证检测的灵敏度和特异性；l 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。与统计分析精确性。11流式细胞仪医学知识流式细胞仪的工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的基本结构（1）液流系统液流系统（2）光学系统光学系统（3）数据处理系统数据处理系统12流式细胞仪医学知识流式细胞仪的基本结构（1）液流系统1 2 流式细胞仪医学知识液液 流流 系系 统统l由样本和鞘液组成由样本和

15、鞘液组成l待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入从样品管进入流动室形成样本流流动室形成样本流l鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。13流式细胞仪医学知识液 流 系 统由样本和鞘液组成1 3 流式细胞仪医学知识光光 学学 系系 统统 由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透由激光光源、

16、分色反光镜、光束成形器、透 镜组、滤片和光电倍增管组成。镜组、滤片和光电倍增管组成。数数 据据 处处 理理 系系 统统主要由计算机和及其软件（主要由计算机和及其软件（flow flow cytometry cxpcytometry cxp）组成）组成。14流式细胞仪医学知识光 学 系 统 由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透 流式细胞术基本原理 1.首先，机器吸取细胞混悬液，然后由鞘液包裹，由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测

17、激发光的强弱。3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）15流式细胞仪医学知识流式细胞术基本原理 1.首先，机器吸取细胞混悬液，然散散 射射 光光 的的 测测 量量 细胞在液柱中与激光束相交时向周围细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光分为前向散射光和侧向散射光侧向散射光。16流式细胞仪医学知识散 射 光 的 测 量 细胞在液柱中与激光束相交时向周围前前 向向 散散

18、 射射 光（光（FSFS）前向散射光前向散射光（forward scatter,forward scatter,FSFS）：激光）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5(0.51010)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比比。17流式细胞仪医学知识前 向 散 射 光（F S）前向散射光（f o r w a r d s流式细胞仪医学知识培训课件光光 散散 射射 测测 量量 的的 用用 途途 测得的测得的FS与与SS信号通信号通过计算机处理，可得过计

19、算机处理，可得FS-SS图，由此可仅用图，由此可仅用散射光信号对未染色的散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的此为血细胞分类的基本原理，但不能分析基本原理，但不能分析表面分子。表面分子。19流式细胞仪医学知识光 散 射 测 量 的 用 途 测得的F S 与S S 信号通过荧荧 光光 的的 测测 量量l荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。l每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，

20、通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。光信号区分开，送入不同的光电倍增管。l选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。多个不同特征。l荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量。荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量。20流式细胞仪医学知识荧 光 的 测 量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受参参 数数 说说 明明lFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小lSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度lFL：反映颗粒被染上的荧光

21、数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少21流式细胞仪医学知识参 数 说 明F S：反映颗粒的大小2 1 流式细胞仪医学知识1.1.单单 参参 数数 直直 方方 图图 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。的颗粒数量的多少。22流式细胞仪医学知识1.单 参 数 直 方 图 由一维参数(散射光或荧光)与颗单单 参参 数数 直直 方方 图图细胞相对数细胞相对数量量信道信道(channel(channel)23流式细胞仪医学知识单 参 数 直 方 图细胞相对数量信道(c h a n

22、 n e l )22.2.双双 参参 数数 直直 方方 图图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。24流式细胞仪医学知识2.双 参 数 直 方 图 双参数直方图：纵

23、轴和横轴分别代双双 参参 数数 直直 方方 图图 点点 图图绿色荧光强绿色荧光强度度红色荧光强红色荧光强度度25流式细胞仪医学知识双 参 数 直 方 图 点 图绿色荧光强度红色荧光强度2 5 流（三）（三）设设 门门 分分 析析 技技 术术 Gate Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定其设置：指根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。中想要分析的特定细胞群。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。26流式细胞仪医学知识（三）设 门 分 析 技 术 G a t e 设置：指

24、根据该图的细任意门A 淋巴细胞淋巴细胞B 单核细胞单核细胞C 中性粒细胞中性粒细胞27流式细胞仪医学知识任意门A 淋巴细胞2 7 流式细胞仪医学知识线性门28流式细胞仪医学知识线性门2 8 流式细胞仪医学知识十字门十字门分析时，由四个区十字门分析时，由四个区阈构成，即阈构成，即G=D1+D2+D3+D4。D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+29流式细胞仪医学知识十字门十字门分析时，由四个区阈构成，即G=D 1+D 2+D 3+开机注意事项1检查鞘液桶（充满3/4状态）2检查废液桶（如需要，清空）3检查清洗液4打开电源箱门，检查并确认A

25、IR FILTER和VAC FILTER 必须干燥无水WATER TRAP 液体不超过1/3VAC TRAP 液体不超过1/4SYS VAC 计量表 读数在-17-30之间SYS PRE 计量表 读数在 283230流式细胞仪医学知识开机注意事项1 检查鞘液桶（充满3/4 状态）3 0 流式细胞仪医学日常保养与维护1.添加鞘液、清洗液2.清空废液桶3.Prime（排除液路系统气泡）4.常规清洗管路和样本头5.清洗真空管路6.清洁空气滤器7.鞘液桶8.清洗液桶9.真空聚水槽每天开机检查，如需要及时添加每天开机检查，如需要及时清空无论何时，更换容器时或做其他保养时，要执行该程序每日或有需要时每日实验结束每周每月每60天必要时31流式细胞仪医学知识日常保养与维护1.添加鞘液、清洗液每天开机检查，如需要及时添 E N D32流式细胞仪医学知识 E N D 3 2 流式细胞仪医