法医病理学-组织切片制作课件.ppt
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1、法医病理学法医病理学组织切片制作组织切片制作法医病理学组织切片制作HE染色切片染色切片H E 染色切片一、目的要求一、目的要求掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋,切片制作。蜡与包埋,切片制作。(一)取材(一)取材1.1.取材快,新鲜,防止组织腐败。取材快,新鲜,防止组织腐败。2.2.取材刀锋利,垂直地切取,严禁挤压或用钳镊取材刀锋利,垂直地切取,严禁挤压或用钳镊钳夹,以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。钳夹,以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。3.3.取材大小,取材大小,lcmlcm3cm3cm1cm1cm2cm2cm0.3cm0.3cm0.5cm
2、0.5cm。材料过大在短时间内不易固定透,影响。材料过大在短时间内不易固定透,影响效果。效果。一、目的要求掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋,切(二)方法:(二)方法:1.1.实质器官实质器官心脏:心脏:心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常组织。可单独取心室肌,乳头肌,组织。可单独取心室肌,乳头肌,3 35 5块。块。肺脏:肺脏:左右两肺(五个肺叶);可根据病变需要决定左右两肺(五个肺叶);可根据病变需要决定取材块数,特殊情况下为区别在不同肺叶上取材,取材块数,特殊情况下为区别在不同肺叶上取材,可用形状做标志在记录时记清楚,可用形状做标志在
3、记录时记清楚,5 57 7块。块。肾脏:肾脏:取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂,应区别左取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂,应区别左右肾,右肾,2 24 4块。块。胰腺:胰腺:取胰体部,必要时加取胰头、胰尾,取胰体部,必要时加取胰头、胰尾,2 2块。块。肝脏:肝脏:取长方形或三角形,取长方形或三角形,2 23 3块。块。脾脏:脾脏:取材带被膜,取材带被膜,2 23 3块。块。(二)方法:1.实质器官心脏:心房、瓣膜、心室。可分别取病脑:脑:全脑(桥脑、延脑、小脑)、脊髓颈全脑(桥脑、延脑、小脑)、脊髓颈段及脉络丛,十一块,或根据具体情况决定:段及脉络丛,十一块,或根据具体情况决定:额极;前后中央回;
4、海马;内囊;额极;前后中央回;海马;内囊;丘脑;枕叶;脉络丛;桥脑;延丘脑;枕叶;脉络丛;桥脑;延髓;中脑;髓;中脑;?小脑。取材时要带上软脑小脑。取材时要带上软脑膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时取脊髓。取脊髓。垂体:垂体:前、中、后叶和垂体柄,从前向后前、中、后叶和垂体柄,从前向后横切。横切。脑:全脑(桥脑、延脑、小脑)、脊髓颈段及脉络丛,十一块,或根2 2管腔脏器:管腔脏器:取材时注意方向,取管腔脏器的全层构造。取材时注意方向,取管腔脏器的全层构造。大肠、小肠:大肠、小肠:应考虑环行皱襞,沿肠管的长轴取应考虑环行皱襞,沿肠管的长轴取(纵切)。(纵
5、切)。食管、气管:食管、气管:横切面为宜。横切面为宜。胃:胃:常规取胃底。常规取胃底。取材后应将被膜面铺在滤纸上,然后入固定液取材后应将被膜面铺在滤纸上,然后入固定液内,防止或减少组织受压变形与收缩。内,防止或减少组织受压变形与收缩。有病变的部位,应附带周围正常组织取材。有病变的部位,应附带周围正常组织取材。2 管腔脏器:取材时注意方向,取管腔脏器的全层构造。大肠、小二、固定二、固定(一)意义:(一)意义:是做好切片的重要步骤之一,如果是做好切片的重要步骤之一,如果首次组织固定不良,再重新固定效果不佳。首次组织固定不良,再重新固定效果不佳。检材固定的关键:取材后尽可能地及时地将检材固定的关键:
6、取材后尽可能地及时地将所取的材料进行固定,以防止其所取的材料进行固定,以防止其“死后死后”变化的变化的进展,尽力使组织接近于生前状态。为了防止组进展,尽力使组织接近于生前状态。为了防止组织结构及成份的破坏和溶解消失,需要使其转变织结构及成份的破坏和溶解消失,需要使其转变为不溶性物质,有利于组织结构保存为不溶性物质,有利于组织结构保存-固定的基固定的基本意义。本意义。二、固定(一)意义:是做好切片的重要步骤之一,如果首次组织固固定的目的:固定的目的:1.1.阻止死后变化,防止组织的自溶与腐败。阻止死后变化,防止组织的自溶与腐败。2 2保存组织的结构及成份。保存组织的结构及成份。3 3媒染作用,使
7、不同的组织成份对染料有不同媒染作用,使不同的组织成份对染料有不同亲和力,使细胞各部易于受色。亲和力,使细胞各部易于受色。4 4能使组织硬化,为制作薄切片奠定基础。能使组织硬化,为制作薄切片奠定基础。注意:注意:材料块不能过大,固定器皿不易过小,固材料块不能过大,固定器皿不易过小,固定液量不易过少,应是固定材料体积的定液量不易过少,应是固定材料体积的 2020一一3030倍。倍。固定的目的:1.阻止死后变化,防止组织的自溶与腐败。2 保存(二)固定液:(二)固定液:根据检验目的不同选择不同种类固定液,如糖原检查:不含水的固根据检验目的不同选择不同种类固定液,如糖原检查:不含水的固定液;电镜检查:
8、锇酸固定液等;定液;电镜检查:锇酸固定液等;HEHE染色:甲醛。染色:甲醛。固定液:固定液:用以固定组织的药剂。用以固定组织的药剂。固定液分类固定液分类:单纯固定液,由一种药剂组成;混合固定液(或复合),:单纯固定液,由一种药剂组成;混合固定液(或复合),由二种以上的药剂组成。由二种以上的药剂组成。1 1选择固定液的标准:选择固定液的标准:具有强的穿透力,固定均匀,能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构具有强的穿透力,固定均匀,能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构保持生活状态。保持生活状态。不使组织过度收缩与膨胀而变形。不使组织过度收缩与膨胀而变形。能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶
9、性物质。能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度便于切片制作。使组织达到一定的硬度便于切片制作。价格便宜,易购买,配制方便。价格便宜,易购买,配制方便。(二)固定液:根据检验目的不同选择不同种类固定液,如糖原检查2单纯固定液单纯固定液乙醇(酒精)、甲醛(福尔马林)、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、乙醇(酒精)、甲醛(福尔马林)、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸冰醋酸(1 1)乙醇(酒精)()乙醇(酒精)(alcoholalcohol)优点:优点:价格低,易购买,易溶于水,使用方便,价格低,易购买,易溶于水,使用方便,9595浓度,无水乙醇浓度,无水乙醇1
10、00100;市售有两种:市售有两种:100%100%;95%95%;能硬化组织起固定作用;能硬化组织起固定作用;也是一种最常用的脱水剂。也是一种最常用的脱水剂。固定用浓度在固定用浓度在70708080,酒精浓度愈大组织收缩愈严重,浓度过低起,酒精浓度愈大组织收缩愈严重,浓度过低起不到固定作用。不到固定作用。缺点:缺点:穿透力小,由于被固定的组织表面硬化,固定液不容易渗透到组织中去,穿透力小,由于被固定的组织表面硬化,固定液不容易渗透到组织中去,所以用乙醇固定的组织材料要小。所以用乙醇固定的组织材料要小。使组织严重收缩。使组织严重收缩。由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,核蛋白的沉淀物易溶于水
11、,由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,核蛋白的沉淀物易溶于水,使细胞核核色不佳。使细胞核核色不佳。溶解脂肪、血红蛋白和多种色素,脂肪染色必须制作冰冻切片。溶解脂肪、血红蛋白和多种色素,脂肪染色必须制作冰冻切片。2 单纯固定液乙醇(酒精)、甲醛(福尔马林)、重铬酸钾、苦味2 2甲醛:(福尔马林)(甲醛:(福尔马林)(formalinformalin)最常用的固定液最常用的固定液,一种还原剂,无色透明极易挥发有强,一种还原剂,无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体,不能与氧化剂混使用。可应用于组织烈刺激性气味的液体,不能与氧化剂混使用。可应用于组织学、组织化学、免疫组织化学等染色,最好用时现配。
12、学、组织化学、免疫组织化学等染色,最好用时现配。商品甲醛:商品甲醛:37374040甲醛水溶液。甲醛水溶液。固定液的浓度:固定液的浓度:4 48 8(习惯上称为(习惯上称为 1010或或2020的福尔马的福尔马林)。林)。固固定定时时间间:常常温温下下固固定定24h24h48h48h。快快速速固固定定,可可加加温温到到70708080或者加温煮沸或者加温煮沸10min10min即可。快速固定,组织块不宜即可。快速固定,组织块不宜过厚或过大,缺点是组织收缩较严重。过厚或过大,缺点是组织收缩较严重。固定液配制:固定液配制:甲醛甲醛1 1份与份与9 9份自来水混合即为份自来水混合即为 1010(4%
13、4%)浓度)浓度的甲醛固定液。的甲醛固定液。2 甲醛:(福尔马林)(f o r ma l i n)最常用的固定液,一优点:优点:渗透力较强;组织收缩小;细胞核染色较好。渗透力较强;组织收缩小;细胞核染色较好。缺点:缺点:质量较差的质量较差的formalinformalin在低温下久存容易产生一种白色的沉在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物称淀物称“三聚甲醛三聚甲醛”(付醛),经氧化成为甲酸而使溶液呈(付醛),经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性,影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸性,影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁,简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或酸钙或碳
14、酸镁,简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。者白色粉笔作为中和剂。酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物,称为福尔马林色素,在切片上形成黑色小颗粒,不溶状物,称为福尔马林色素,在切片上形成黑色小颗粒,不溶于水和酒精,影响染色效果和切片的观察。于水和酒精,影响染色效果和切片的观察。优点:渗透力较强;组织收缩小;细胞核染色较好。缺点:去掉福尔马林色素颗粒方法:去掉福尔马林色素颗粒方法:Schridde法法25氨水氨水75酒精酒精l ml200 ml切片脱蜡经切片脱蜡经70酒精时,用上液浸泡半小时或稍长一酒精时,
15、用上液浸泡半小时或稍长一些时间,然后水洗再行染色。些时间,然后水洗再行染色。Verocay法法l氢氧化钾水溶液氢氧化钾水溶液70酒精酒精l ml100 ml切片脱蜡经酒精切片脱蜡经酒精80时入上液处理时入上液处理10分钟,经分钟,经70酒酒精入水后即可染色。精入水后即可染色。去掉福尔马林色素颗粒方法:S c h r i d d e 法2 5 氨水7 5(三)水洗(三)水洗1.1.用水道流水洗涤,彻底清除组织块中的固定液。用水道流水洗涤,彻底清除组织块中的固定液。2.2.水洗时间数小时至水洗时间数小时至2424小时。小时。3.3.根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具,可用水洗根据材料多少、大小可
16、灵活掌握水洗工具,可用水洗筐或用纱布包裹,防止水流过大将组织块冲掉或丢失。筐或用纱布包裹,防止水流过大将组织块冲掉或丢失。(四四)脱水脱水组织块固定后虽然已经硬化,但达不到切薄片的硬度,组织块固定后虽然已经硬化,但达不到切薄片的硬度,必须制成石蜡组织块,脱水是继固定后的重要步骤。必须制成石蜡组织块,脱水是继固定后的重要步骤。经固定和水洗后的组织含大量水分,在这种情况下首经固定和水洗后的组织含大量水分,在这种情况下首先必须除去组织内部的水分,这种除水的过程叫做脱水,先必须除去组织内部的水分,这种除水的过程叫做脱水,脱水使用的药剂称为脱水剂。脱水使用的药剂称为脱水剂。脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始
17、到高浓度酒,否则脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒,否则引起组织强烈收缩,变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸引起组织强烈收缩,变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸进石蜡。进石蜡。(三)水洗1.用水道流水洗涤,彻底清除组织块中的固定液。2.常用脱水剂:常用脱水剂:溶于水和透明剂的试剂,如酒精、丙酮、正丁醇溶于水和透明剂的试剂,如酒精、丙酮、正丁醇等。等。(1 1)酒精)酒精步骤:步骤:7070808090909595100100100100,一般数小时到,一般数小时到1212小时,更换一次酒精。小时,更换一次酒精。配低浓度酒精时,可用市售配低浓度酒精时,可用市售 9595酒精配制。酒精配制。70
18、70酒精:酒精:9595酒精酒精70ml70ml加蒸馏水加蒸馏水 25ml25ml至至95ml95ml;8080酒精:酒精:9595酒精酒精80ml80ml加蒸馏水至加蒸馏水至95ml95ml,依次类推。,依次类推。(2 2)丙酮)丙酮脱水作用与酒精相似,虽其脱水作用比酒精强,但可引脱水作用与酒精相似,虽其脱水作用比酒精强,但可引起组织块的收缩较,价钱较贵,故不宜用于一般组织脱水,起组织块的收缩较,价钱较贵,故不宜用于一般组织脱水,它即有脱水作用又有透明作用,用丙酮固定的材料要小,脱它即有脱水作用又有透明作用,用丙酮固定的材料要小,脱水水1 18 8小时即可。小时即可。常用脱水剂:溶于水和透明
19、剂的试剂,如酒精、丙酮、正丁醇等。(五)透明(五)透明目的:目的:因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态,习惯上将用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态,习惯上将石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明,用于透明的试剂称为透石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明,用于透明的试剂称为透明剂。明剂。透明时间:透明时间:根据组织块的大小而定,根据组织块的大小而定,一般一般2020分钟至分钟至1 1小时小时。组织。组织块过大可延长透明时间,透明好的材料如同油炸的感觉呈透明块过大可延长透明时间,透明好的材料如同
20、油炸的感觉呈透明状。状。透明剂:透明剂:二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。最常用二甲苯最常用二甲苯。二甲苯:二甲苯:无色透明有机溶媒,有很强的刺激气味,易挥发,无色透明有机溶媒,有很强的刺激气味,易挥发,长期接触对粘膜有刺激作用,透明作用很强,可使组织收缩变长期接触对粘膜有刺激作用,透明作用很强,可使组织收缩变形,透明时间不宜过长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白形,透明时间不宜过长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时说明脱水不彻底,如果造成透明不彻底应退回到色混浊状态时说明脱水不彻底,如果造成透明不彻底应退回到100100酒精中重新透明。酒精中重新透明。(
21、五)透明目的:因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒六、浸蜡与包理:六、浸蜡与包理:浸蜡的目的:浸蜡的目的:为了能制作薄切片做准备,将透明为了能制作薄切片做准备,将透明好的组织块浸到融化的石蜡中,使石蜡渗透到组好的组织块浸到融化的石蜡中,使石蜡渗透到组织细胞内,将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取织细胞内,将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来,再用石蜡将组织包埋,冷却后,切成小代出来,再用石蜡将组织包埋,冷却后,切成小块,修整好切面,这一过程为浸蜡与包埋。块,修整好切面,这一过程为浸蜡与包埋。六、浸蜡与包理:浸蜡的目的:为了能制作薄切片做准备,将透明好具体操作:具体操作:(一)浸蜡(一)浸
22、蜡石蜡箱温度石蜡箱温度5860左右,内有标明左右,内有标明、的蜡杯的蜡杯或蜡缸,从透明的二甲苯或蜡缸,从透明的二甲苯取出组织块,放入取出组织块,放入号蜡杯中号蜡杯中2h3h,再将组织块移入,再将组织块移入号蜡杯(纯蜡)号蜡杯(纯蜡)2h4h,再,再移入移入号蜡杯中(纯蜡)半天或者稍降蜡箱温度过夜,最号蜡杯中(纯蜡)半天或者稍降蜡箱温度过夜,最后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。注意:注意:浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用,以免脱二甲浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用,以免脱二甲苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关
23、闭蜡箱,需要时再开。温度越高,时间越长组织温度或关闭蜡箱,需要时再开。温度越高,时间越长组织块收缩越严重,而且材料脆而不易制作切片。块收缩越严重,而且材料脆而不易制作切片。具体操作:(一)浸蜡石蜡箱温度5 8 6 0 左右,内有标明(二)包埋:(二)包埋:包埋方法:包埋方法:石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法、环氧树脂包埋法(电镜用)等。包埋法、环氧树脂包埋法(电镜用)等。步骤:纯石蜡溶解后(步骤:纯石蜡溶解后(60)倒入包埋框内或纸盒内,迅速)倒入包埋框内或纸盒内,迅速将浸好的组织块的切面向下、放平,依次摆入框内,待蜡逐将浸好的组织块的
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