新技术在医学实验中的应用优质课件.ppt

1、新技术在医新技术在医学实验中的学实验中的应用应用内容提纲内容提纲一实验方法介绍一实验方法介绍 检测蛋白表达水平方法：检测蛋白表达水平方法：Western blot,2D-gel,免疫共沉淀，免疫共沉淀，Shotgun，免疫组化，流式细胞测定，免疫组化，流式细胞测定，绿荧光蛋白标记法，萤光，绿荧光蛋白标记法，萤光素酶标记法，素酶标记法，ELISA.检测检测DNA/RNA表达水平方法：表达水平方法：Southern blot,Northern blot,原位杂交原位杂交,PCR.基因操作方法基因操作方法:基因敲除，基因沉默基因敲除，基因沉默.内容提纲内容提纲二实用技术介绍二实用技术介绍 细胞活性检

2、测：细胞活性检测：MTT,MTS，CCK-8,Calcein-AM.细胞凋亡检测：细胞凋亡检测：Western blot,流式，流式，TUNEL,Hoechst 33258，DNA ladder.活性氧自由基（活性氧自由基（ROS）检测：）检测：DCF,SOD,GSH,ESR.Western blotWestern blotWestern blot2D-Gel免疫共沉淀免疫共沉淀 是一种着重检测蛋白是一种着重检测蛋白-蛋白或蛋白蛋白或蛋白-核酸间核酸间联系的方法。联系的方法。基本原理是利用抗原抗体结合基本原理是利用抗原抗体结合,以及与抗体以及与抗体相连的小珠（相连的小珠（Beads）,以物理方

3、式将目标以物理方式将目标蛋白连同与其相结合的物质分离出来单独蛋白连同与其相结合的物质分离出来单独分析。分析。分离后，解离蛋白，以分离后，解离蛋白，以Western blot的方式的方式检测潜在目标的水平，即可得知目标间在检测潜在目标的水平，即可得知目标间在细胞中是否有紧密联系。细胞中是否有紧密联系。免疫共沉淀免疫共沉淀Chromatin immunoprecipitation（CHIP）“猎枪猎枪”法法（Shotgun proteomic）免疫组化免疫组化Immunohistochemistry 原理类似原理类似Western blot，但直接在组织切片，但直接在组织切片（或在满足一定条件的情

4、况下，整个组织）（或在满足一定条件的情况下，整个组织）上进行，保留了原始组织结构，能提供更上进行，保留了原始组织结构，能提供更多的信息。多的信息。缺点：费时，目标蛋白表达不高时不易检缺点：费时，目标蛋白表达不高时不易检测到，量化统计不易。测到，量化统计不易。免疫组化样本制备免疫组化样本制备 通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米厚）通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米厚）.足够小且能被完全通透化（足够小且能被完全通透化（Permeabilize)的组织可以直接的组织可以直接做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。冷冻切片信号较好，但

5、受时间，地点，存放条件等限制。冷冻切片信号较好，但受时间，地点，存放条件等限制。石蜡切片具有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方石蜡切片具有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方可进行免疫组化染色，且效果一般差于冷冻切片。可进行免疫组化染色，且效果一般差于冷冻切片。免疫组化的抗体使用免疫组化的抗体使用 免疫组化中使用的一抗通常与免疫组化中使用的一抗通常与Western blot中用的相同。中用的相同。二抗被设计成与一抗的宿主结合的抗体，一般结合有探测二抗被设计成与一抗的宿主结合的抗体，一般结合有探测用分子，免疫组化中常用的是生物素（用分子，免疫组化中常用的是生物素（biotin）。）。一抗宿

6、主一般不能与实验所用组织同种，但必要时也有专一抗宿主一般不能与实验所用组织同种，但必要时也有专用试剂可以允许这种应用用试剂可以允许这种应用 例子：例子：MOM （Mouse on Mouse)Kit。不同的探测方法不同的探测方法 直接探测法：直接标记一抗，不需使用二直接探测法：直接标记一抗，不需使用二抗来探测目标蛋白表达水平，最简单但敏抗来探测目标蛋白表达水平，最简单但敏感度最差，基本已不用。感度最差，基本已不用。间接探测法：一抗没有标记，然后用抗一间接探测法：一抗没有标记，然后用抗一抗的二抗来间接探测目标蛋白表达水平。抗的二抗来间接探测目标蛋白表达水平。有信号放大作用，敏感度好，节省试剂。有

7、信号放大作用，敏感度好，节省试剂。间接探测法介绍：间接探测法介绍：PAP法法 PAP:peroxidase anti-peroxidase method PAP法使用未标记的一抗和二抗，之后加入第三层的探针：法使用未标记的一抗和二抗，之后加入第三层的探针：peroxidaseperoxidase及其抗体，且抗体的抗原性与一抗相同，都与及其抗体，且抗体的抗原性与一抗相同，都与二抗相结合。如此以二抗为中心形成二抗相结合。如此以二抗为中心形成“三明治三明治”结构。结构。Avidin-Biotin Complex(ABC)法法 免疫组化最常用方法之一。免疫组化最常用方法之一。也是形成也是形成“三明治三

8、明治”样结构，使用未标记的一抗，生物素样结构，使用未标记的一抗，生物素（biotin）标记的二抗，生物素标记的）标记的二抗，生物素标记的peroxidase以及生物以及生物素结合蛋白（素结合蛋白（Avidin）。）。需要封闭内源性的需要封闭内源性的 peroxidase。必要时，封闭内源性必要时，封闭内源性 的的biotin。Labeled Streptavidin Biotin(LSAB)法法 与与ABC法相似，但使用法相似，但使用Strptavidin替换一替换一般的生物素结合蛋白，其与组织的非特异般的生物素结合蛋白，其与组织的非特异性结合较少，因此可以降低背景。性结合较少，因此可以降低背

9、景。免疫组化中的注意要点免疫组化中的注意要点 样本的准备样本的准备 封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性的的peroxidase，内源性的，内源性的biotin）抗体浓度抗体浓度 培养温度培养温度 显色时间显色时间 (Flow Cytometer)是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术（行快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术（Flow Cytometry)是上世纪是上世纪70年代发展起来的一项新技术。它通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进年代发展起来的一项新技术。它通过对流动液体中排成

10、单列的细胞或颗粒进行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结构、构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学特征。、蛋白质、抗原等物理或化学特征。要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损伤。伤。Black:control,Purple:UVB model,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.Reporter As

11、say 为检测特定基因能否在目标生物体内表达为检测特定基因能否在目标生物体内表达及表达水平，及表达水平，Reporter assay常被使用。常被使用。绿荧光蛋白标记绿荧光蛋白标记Osamu Shimomura,Martin Chalfie 及及 Roger Tsien 于于20082008年因绿荧光蛋白年因绿荧光蛋白的发现，获诺贝尔化学奖。的发现，获诺贝尔化学奖。荧光素酶标记荧光素酶标记 直接直接ELISA:直接使用酶标记的一抗探测固定的抗原。最直接使用酶标记的一抗探测固定的抗原。最为简单，避免二抗可能的交叉反应，但敏感性较差，需要为简单，避免二抗可能的交叉反应，但敏感性较差，需要大量昂贵的

12、标记抗体。大量昂贵的标记抗体。间接间接ELISA:不直接标记一抗，而是标记抗一抗的二抗。不直接标记一抗，而是标记抗一抗的二抗。信号可以被有效放大，且一抗免疫活性不会受标记的影响。信号可以被有效放大，且一抗免疫活性不会受标记的影响。但二抗可能发生交叉反应。但二抗可能发生交叉反应。“三明治三明治”ELISA:先在盘中固定一层捕获抗体先在盘中固定一层捕获抗体（Capture antibody），以之将目标抗原捕获，之后再使），以之将目标抗原捕获，之后再使用一层标记的探测抗体。两种抗体必须小心选择以避免相用一层标记的探测抗体。两种抗体必须小心选择以避免相互之间的反应。此法不需纯化抗原，同时具有极高的敏

13、感互之间的反应。此法不需纯化抗原，同时具有极高的敏感性和特异性。但对抗原有要求：至少有两个结合位点。性和特异性。但对抗原有要求：至少有两个结合位点。竞争性竞争性 ELISA:样本和纯化并事先固定的目标抗原对标样本和纯化并事先固定的目标抗原对标记的抗体进行竞争，如果样本中存在目标抗原，最终得到记的抗体进行竞争，如果样本中存在目标抗原，最终得到的信号就会下降。此法可用于不纯的样本，重复性可靠，的信号就会下降。此法可用于不纯的样本，重复性可靠，但敏感性和特异性都较低。但敏感性和特异性都较低。ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试

14、验）ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其他实验结酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其他实验结果，如蛋白定量，各种酶活性检测，果，如蛋白定量，各种酶活性检测，MTT等。等。新式酶标仪除读取一般吸光度外，还可以读取荧光数据：实验者新式酶标仪除读取一般吸光度外，还可以读取荧光数据：实验者指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功能的酶标仪即可读取指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功能的酶标仪即可读取该数据。同时还有的酶标仪带加温，该数据。同时还有的酶标仪带加温，振荡，定时重

15、复读取等等功能，极大振荡，定时重复读取等等功能，极大地方便了实验。地方便了实验。Southern BlottingNorthern BlottingIn situ hybridization(举例：原位杂交检测举例：原位杂交检测p21mRNAPCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应，是研究工作中最常用到聚合酶链式反应，是研究工作中最常用到的技术之一。的技术之一。Taq DNA聚合酶聚合酶在黄石国家公园沸泉的耐热细菌中发现并分离，在在黄石国家公园沸泉的耐热细菌中发现并分离，在7272摄氏度下可正常摄氏度下可正常反应，高达反应，高达9595摄氏度的情况下仍不变性，

16、是摄氏度的情况下仍不变性，是PCR反应得以进行的基础。反应得以进行的基础。现代技术已经在此基础上发展出多种改良型的耐高温现代技术已经在此基础上发展出多种改良型的耐高温DNA聚合酶，使聚合酶，使反应效率提升，反应条件要求降低。反应效率提升，反应条件要求降低。PCR条件条件 DNA聚合酶。聚合酶。反应所需模板（反应所需模板（Template），），DNA分子。分子。反应所需引物（反应所需引物（Primer），两个方向。），两个方向。反应所需原料（反应所需原料（dNTPs）。）。适宜的缓冲液。适宜的缓冲液。适宜的反应温度。适宜的反应温度。Real-time PCR还需要荧光染料。还需要荧光染料。目前

17、很多试剂厂商以目前很多试剂厂商以“Master Mix”的形式提供的形式提供PCR试剂，极大地方便了实验。试剂，极大地方便了实验。PCR的分类的分类 以以DNA为起始点的为起始点的PCR （目的为大量复制（目的为大量复制扩增目标基因）扩增目标基因）。以以RNA为起始点的为起始点的PCR （RT-PCR，目的，目的为检测目标基因表达强度），其又可分为为检测目标基因表达强度），其又可分为一般的一般的RT-PCR和和Real-time RT-PCR。RT-PCR的一般步骤的一般步骤 1.1.RNA的抽提的抽提 经典的方法是利用经典的方法是利用RNA在酒在酒精中溶解度低使之析出。较新精中溶解度低使之析

18、出。较新的的RNA抽提试剂盒在此基础上抽提试剂盒在此基础上利用了能特异性与利用了能特异性与RNA结合的结合的微型分离柱，大大提高微型分离柱，大大提高RNA产产率和纯度。率和纯度。2.2.检测检测RNA质量和浓度质量和浓度 比色法检测比色法检测OD260/280260/280和和OD260/230260/230，前者在，前者在DNADNA应该应该为为1.81.8而而RNARNA应该为应该为2 2左右，后左右，后者应该在者应该在2.0-2.22.0-2.2左右左右.Nanodrop仪器可用极小量样仪器可用极小量样本作快捷而相对准确的检测。本作快捷而相对准确的检测。RT-PCR的一般步骤的一般步骤

19、3.3.逆转录。一般应用试剂盒进行，将逆转逆转录。一般应用试剂盒进行，将逆转录酶，录酶，mRNA逆转录引物及相应的原料，逆转录引物及相应的原料，缓冲液等与抽提到的缓冲液等与抽提到的RNA混合，在适宜温混合，在适宜温度下，从度下，从RNA逆转录得到逆转录得到cDNA。4.4.PCR反应。将反应。将PCR各原料，引物及模板各原料，引物及模板混合后，在混合后，在PCR仪上进行反应。如为一般仪上进行反应。如为一般RT-PCR，反应结束后取产物电泳，反应结束后取产物电泳，EB染染色后凝胶成像分析，如为色后凝胶成像分析，如为Real-time PCR，反应结束后直接取数据分析即可。反应结束后直接取数据分析

20、即可。半定量半定量RT-PCR 直接完成指定周期数直接完成指定周期数的的PCR反应后，以电反应后，以电泳及泳及EB染色法确定终染色法确定终产物的量。产物的量。优点：不需特别试剂优点：不需特别试剂和仪器，成本低廉。和仪器，成本低廉。缺点：检测的敏感度缺点：检测的敏感度较差，实验步骤较繁较差，实验步骤较繁琐，且涉及有毒试剂琐，且涉及有毒试剂EB的使用。的使用。Real-Time PCR 借助与双链借助与双链DNA特异性结特异性结合发出荧光的特殊染料合发出荧光的特殊染料（如（如SYBR Green），在），在每一个每一个PCR周期完成后都周期完成后都读取一次产物的量，可以读取一次产物的量，可以得到实

21、时的得到实时的PCR产物扩增产物扩增的数量并较精确地定量分的数量并较精确地定量分析。析。优点：反应敏感度好，优点：反应敏感度好，CT(Cycle threshold)值的值的测定避免了非线性扩增对测定避免了非线性扩增对结果的干扰。结果的干扰。缺点：需要专用缺点：需要专用PCR仪器，仪器，器材及试剂价格较昂贵。器材及试剂价格较昂贵。Real-Time PCR示例示例PCR易出现的问题易出现的问题 产物错误：引物设计不佳产物错误：引物设计不佳/结合温度有误结合温度有误/存在污染存在污染/镁离子浓度不当。镁离子浓度不当。无产物：引物设计不当或引物数量不足无产物：引物设计不当或引物数量不足/存存在干扰

22、反应物质在干扰反应物质/污染污染/实验方法或设备问实验方法或设备问题。题。多重产物：结合温度设置太低多重产物：结合温度设置太低/镁离子浓度镁离子浓度不当不当/引物过多或生成引物二聚体引物过多或生成引物二聚体/外来外来DNA污染。污染。多重产物及解决实例多重产物及解决实例 左上为多重产物实例。可左上为多重产物实例。可以看到虽然只加入一种引以看到虽然只加入一种引物，此反应却生成了两种物，此反应却生成了两种产物。产物。调整实验条件（主要是结调整实验条件（主要是结合温度）后，同一反应得合温度）后，同一反应得到均一产物。到均一产物。Microarray基因敲除基因敲除经典的基因敲除法（经典的基因敲除法（

23、Knockout），将目标基因替换为一个外源），将目标基因替换为一个外源性的基因（常用耐新霉素基因以方便筛选细胞），从而敲除目性的基因（常用耐新霉素基因以方便筛选细胞），从而敲除目标基因。相对来讲，经典基因敲除法较为简单。但有一些不足标基因。相对来讲，经典基因敲除法较为简单。但有一些不足之处，如有的基因敲除就无法让动物生存，有的会被代偿等。之处，如有的基因敲除就无法让动物生存，有的会被代偿等。条件敲除（条件敲除（Conditional Knockout）一般是靠）一般是靠Cre-LoxP/FLP-Frt 重组系统来完成，目标基因上被加入重组系统来完成，目标基因上被加入LoxP或或Frt元素，带

24、有元素，带有LoxP的小鼠与在某些组织上特异性表达的小鼠与在某些组织上特异性表达Cre（或者（或者Flp）的小鼠交配，）的小鼠交配，后代的特定器官上的该基因即被敲除。易导致错位翻译。后代的特定器官上的该基因即被敲除。易导致错位翻译。四环素控制的条件基因表达四环素控制的条件基因表达/沉默：转录的激活子（沉默：转录的激活子（Transactivator）rTA，在无四环素存在的前提下，能与一个特别定制的操纵子在无四环素存在的前提下，能与一个特别定制的操纵子tet-O结合，激活下结合，激活下游目标基因的表达，而四环素（如多西环素）的应用将使此激活子与四环游目标基因的表达，而四环素（如多西环素）的应用

25、将使此激活子与四环素结合，迅速中止目标基因的表达。素结合，迅速中止目标基因的表达。空白对照组、空白对照组、UVB模型组、模型组、UVB试剂对照组试剂对照组 (不加不加siRNA,仅加入转染试剂仅加入转染试剂)、UVBsiRNA 组组 接种细胞至接种细胞至6 孔板孔板 让其在有血清无抗生素的培养基中生长，让其在有血清无抗生素的培养基中生长，使得转染时细胞融合度达使得转染时细胞融合度达60%80%转染转染 siRNA 组每孔加入组每孔加入800L转染复合物转染复合物8L siRNA溶于溶于100L转染培养基转染培养基8L siRNA转染试剂溶于转染试剂溶于100L转染培养基转染培养基 37、5%C

26、O2孵育孵育57h 去除转染复合物，去除转染复合物，更换含更换含10%小牛血清的正常培养基小牛血清的正常培养基 37、5%CO2 细胞培养箱中孵育细胞培养箱中孵育1824h 转染转染48h后进行后进行UVB照射照射30min 干扰效率的检测干扰效率的检测 RT-PCR干扰后干扰后Fas mRNA的表达检测水平的表达检测水平 Western blot检测干扰后检测干扰后Fas蛋白的表达水平蛋白的表达水平常用实验技术介绍常用实验技术介绍细胞活性细胞活性（Cell Viability）检测检测 检测样本中活细胞的相对数量。最为常用的实验检测样本中活细胞的相对数量。最为常用的实验手段之一，在抑瘤，毒理

27、，细胞保护等实验中都手段之一，在抑瘤，毒理，细胞保护等实验中都必不可少。必不可少。MTT MTS CCK8 Calcein-AM染色染色 PI染色染色 Trypan Blue染色染色MTT法法 MTT的改进型的改进型：MTS MTS是在是在MTT的基础上加以的基础上加以改进的一种四唑盐，改进的一种四唑盐，Promega公司将其与电子偶联剂公司将其与电子偶联剂PES稳定混合，形成稳定混合，形成单一溶液形式，易用而稳定的细胞活力检单一溶液形式，易用而稳定的细胞活力检测试剂。测试剂。CCK-8法法 CCK-8（Cell Counting Kit-8），），是碧云天公司推出是碧云天公司推出的另一种的另

28、一种MTT改进改进型，基于型，基于MTT的另的另一个衍生物一个衍生物WST-8，与与MTS法法相似，只相似，只需将单一溶液加入需将单一溶液加入即可测定活细胞相即可测定活细胞相对数量。对数量。Calcein-AM染色染色 Calcein-AM是一种是一种荧光染料荧光染料Calcein的前的前体，能穿透细胞膜，体，能穿透细胞膜，在活细胞中被转化为在活细胞中被转化为Calcein，荧光强度与，荧光强度与活细胞数量成正比。活细胞数量成正比。可用于荧光显微镜下可用于荧光显微镜下标记细胞。标记细胞。PI染色法染色法 Propidium Iodide(PI)为为DNA的嵌入剂的嵌入剂（Intercalato

29、r），），同时为同时为一荧光染料。一荧光染料。PI的特性是无法穿过活细的特性是无法穿过活细胞膜，因此其能被用来确胞膜，因此其能被用来确定死细胞。定死细胞。前面流式细胞术已经介绍前面流式细胞术已经介绍过通过过通过PI染色确定细胞是染色确定细胞是否死亡的方法。否死亡的方法。Trypan Blue染色法染色法 Trypan Blue(台盼蓝）也是一种只能染色台盼蓝）也是一种只能染色死细胞的染料，与死细胞的染料，与PI的不同之处是其染色的不同之处是其染色肉眼可见，可给出直观肉眼可见，可给出直观 的细胞生存与否的表述。的细胞生存与否的表述。细胞凋亡检测细胞凋亡检测 Western blot 流式细胞术流

30、式细胞术 TUNEL Hoechst 33258染色染色 DNA ladder细胞凋亡的信号通路细胞凋亡的信号通路Western blot检测细胞凋亡检测细胞凋亡 需要同时检测两个目标：需要同时检测两个目标：Caspase-3及及PARP（Poly ADP-Ribose Polymerase）Caspase-3在正常细胞中以前体酶在正常细胞中以前体酶（Procaspase-3）的形式存在，约为的形式存在，约为32KD。凋亡发生时，前体酶被剪切为具有活性的凋亡发生时，前体酶被剪切为具有活性的Caspase-3，两个，两个 亚基分别约为亚基分别约为17KD和和 12KD（分子量随不同（分子量随不同

31、 物种有少量波动）物种有少量波动）PARP是一个是一个DNA修复酶，是激活的修复酶，是激活的caspase-3的的底物。正常全长的底物。正常全长的PARP为为116KD,被被caspase-3剪切后则被分为剪切后则被分为89KD和和24KD两段。两段。流式细胞术法检测凋亡流式细胞术法检测凋亡 在流式细胞术一节已经讲到，以在流式细胞术一节已经讲到，以Annexin V/PI双染色法双染色法 结合流式细胞仪即可分辨正结合流式细胞仪即可分辨正常活细胞，早期凋亡细胞及晚期凋亡常活细胞，早期凋亡细胞及晚期凋亡/坏死坏死细胞。细胞。TUNEL Terminal deoxynucleotidyl trans

32、ferase dUTP nick end labeling。末端脱氧核苷酸。末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记。转移酶脱氧尿苷三磷酸切口末端标记。基于基于Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)的应用。的应用。凋亡发生时，凋亡发生时，DNA被切断，暴露的残端可被切断，暴露的残端可以被以被TdT识别，进而将识别，进而将dNTP联接到联接到DNA残残端上。通过标记端上。通过标记dNTP，凋亡的细胞可以被，凋亡的细胞可以被在位标记出来。在位标记出来。对照组对照组UVB模型组模型组UVB+维生素维生素C(5.68 mmolL-1)UVB+扇贝多肽

33、扇贝多肽(1.42 mmolL-1)UVB+扇贝多肽扇贝多肽(2.84 mmolL-1)UVB+扇贝多肽扇贝多肽(5.69 mmolL-1)活性氧自由基检测活性氧自由基检测 H2DCFDA染色染色 GSH含量检测含量检测 SOD活性检测活性检测 ESR法法H2DCFDA染色染色 H2DCFDA，全称，全称2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，是一种可穿过细胞膜的荧光染料前体。其能，是一种可穿过细胞膜的荧光染料前体。其能为活性氧自由基转化为荧光染料，从而给出细胞内活性为活性氧自由基转化为荧光染料，从而给出细胞内活性氧自由基的水平。氧自由基的水平。可用流

34、式细胞仪，荧光显微镜，共聚焦显微镜或者带荧可用流式细胞仪，荧光显微镜，共聚焦显微镜或者带荧光测定功能的酶标仪检测。光测定功能的酶标仪检测。要求细胞膜完整。要求细胞膜完整。能再次穿膜而出，影响检测的精确度和敏感度。能再次穿膜而出，影响检测的精确度和敏感度。改进型的改进型的CM-H2DCFDA 能更好地待在细胞内，但能更好地待在细胞内，但 价格昂贵得多价格昂贵得多。GSH含量检测含量检测 谷胱甘肽是细胞内主要的内源性抗氧化物谷胱甘肽是细胞内主要的内源性抗氧化物质。以还原态（质。以还原态（GSH）和氧化态（）和氧化态（GSSG)两种形式存在，谷胱甘肽还原酶（两种形式存在，谷胱甘肽还原酶（GR）可）可

35、消耗消耗NADPH将将GSSG转化为转化为GSH。正常细胞中谷胱甘肽主要以正常细胞中谷胱甘肽主要以GSH形态存在。形态存在。GSH含量的下降或者含量的下降或者GSH/GSSG比值的下比值的下降可以间接说明氧化应激压力的存在。降可以间接说明氧化应激压力的存在。单测单测GSH或测或测GSH/GSSG比值都可以。比值都可以。GSH/GSSG比例示例比例示例 GSH/GSSG Ratio Detection Assay Kit(Fluorometric-Green)(ab138881)配制两种不同的检测试剂，一种只对配制两种不同的检测试剂，一种只对GSH起反应，一种对所有谷胱甘肽都起反应。起反应，一种对所有谷胱甘肽都起反应。可以容易地算出比值。可以容易地算出比值。操作简便。操作简便。较为昂贵。较为昂贵。SOD活性活性 WST法，利用黄嘌呤氧化酶（法，利用黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase）产生超氧化物使产生超氧化物使WST转化为染料，转化为染料，SOD可以抑制可以抑制此反应，故此法可间接测得此反应，故此法可间接测得SOD活性。活性。UVAUVA+PCFQuestions?