乙肝疫苗的制备培训课件.ppt

1、乙肝疫苗的制备乙型病毒性肝炎乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。乙肝疫苗的制备2乙肝疫苗的概念乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，

2、将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的制备3乙肝疫苗的发展史乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿童，因为儿童的感染率极高。2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品

3、乙肝疫苗的制备4疫苗的组成疫苗的组成抗原抗原免疫佐剂免疫佐剂乙肝疫苗的制备5乙肝疫苗的制备目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗-重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带者的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血）乙肝疫苗的制备6目的基因的目的基因的 分离分离培养酵母细培养酵母细胞（增）胞（增）检测正确表

4、达目的产物检测正确表达目的产物的酵母（检）的酵母（检）0.0重组酵母构建重组质粒的构重组质粒的构建（切，接）建（切，接）导入酵母细导入酵母细胞（转胞（转）转转细胞转化手段将细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞重组分子导入酵母细胞内。内。增增短时间培养转化酵短时间培养转化酵母细胞，以扩母细胞，以扩DNA重组分子。重组分子。检检检检接接用用DNA连接酶将含有外连接酶将含有外源基因的源基因的DNA片段连接片段连接到质粒分子上，构成到质粒分子上，构成DNA重组分子。重组分子。根据已经测定的编码乙肝病根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的

5、用化学合成法直接合成目的基因。基因。用识别相同黏性末端的限制用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源性内切酶将外源DNA和质粒和质粒分子切开。分子切开。切切筛选和鉴定经转化处理筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工基因高效表达的基因工程菌程菌乙肝疫苗的制备8菌种制备和发酵用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行 大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中

6、，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。乙肝疫苗的制备9分离纯化细胞破碎细胞破碎微滤微滤超滤超滤微滤微滤超滤超滤硅胶吸附硅胶吸附疏水层析疏水层析硫氰酸盐处理硫氰酸盐处理凝胶层析凝胶层析离子交换离子交换层析层析无菌过滤无菌过滤无菌过滤无菌过滤氢氧化铝共沉淀氢氧化铝共沉淀乙肝疫苗的制备10细胞破碎细胞破碎 微滤微滤 超超滤滤 发酵结束后

7、，通过过滤或离心，使酵母与发酵发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用细胞裂解物用0.2um0.2um中空纤维柱

8、进行微滤。中空纤维柱进行微滤。抗抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。乙肝疫苗的制备11凝胶层析凝胶层析离子交换离子交换层析层析乙肝疫苗的制备12凝胶层析分离原理单个凝胶珠本身象个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的

9、小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。乙肝疫苗的制备13凝胶层析分离原理示意图乙肝疫苗的制备14凝胶层析凝胶层析离子交换离子交换层析层析乙肝疫苗的制备15离子交换层析原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一

10、种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。乙肝疫苗的制备16离子交换层析示意图乙肝疫苗的制备17 无菌过滤无菌过滤氢氧化铝共沉淀氢氧化铝共沉淀 分装分装纯化后的抗原

11、再与氢氧化铝共纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。在氢氧化铝上。乙肝疫苗的制备18疫苗纯度的测定乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。对重组酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用0.1mol/L DTT（DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇）与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。DTT结构式乙肝疫苗的制备19疫苗的保存疫苗的稳定性较差，一般在28下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。乙肝疫苗的制备20Thank you!H B s A g v a c c i n e p r e p a r a t i o nH e L i a o n i n g M e d i c a l C o l l e g e乙肝疫苗的制备21