总RNA提取及免疫组化课件.ppt

1、细胞总细胞总RNA的提取的提取2015-07-21 1、mRNA:1-5%2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基大亚基60S:28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基小亚基40S:18S=1874nt ：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免尽量避免源性源性RNase 污染污染 A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）

2、C.一次性塑料器材最好是新开封，一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制、抑制源性源性RNase 活性：活性：RNase 抑制剂抑制剂。1)1)样品处理：样品处理：（）培养细胞：收获细胞（）培养细胞：收获细胞 1-5 1-510 7 10 7，移入，移入 1.5ml 1.5ml 离心管中，加入离心管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol，混匀，混匀，室温静置室温静置 1010min min。（）组织：

3、取（）组织：取 50-100mg 50-100mg 组织（新鲜或组织（新鲜或-70 -70 及液氮中保存的组织均可）置及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 1.5ml 离心离心管中，加入管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置充分匀浆，室温静置1010 min min。2 2)加入加入200 200 l l，震荡混匀震荡混匀20-30s20-30s，室温放置室温放置5min5min（此期间液体开始（此期间液体开始，此时不要轻易搅动液体此时不要轻易搅动液体）。）。3 3)10000 rpm)10000 rpm，离心，离心5min5min。RNA(清澈透明清澈透

4、明)DNAProtein4 4)将清澈透明的将清澈透明的 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。5 5)沉淀沉淀RNARNA：加入加入0.5ml0.5ml，上下颠倒混匀，室温放置，上下颠倒混匀，室温放置10min10min。10000rpm 10000rpm，离心，离心10min10min。弃上清。弃上清。6 6)加加1ml1ml 洗涤管壁。洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)7 7)7500rpm)7500rpm离心离心1min1min，弃上清。，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体

5、（用加样器）完全移净。用用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在时，全程均在室温室温进行。进行。当当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在沉淀用水溶解后，应该注意在冰上冰上操作，操作要迅速。操作，操作要迅速。8 8)室温干燥室温干燥3 35min5min。（干燥的时间由（干燥的时间由RNARNA沉淀大小决定）沉淀大小决定）（干燥后的沉淀应该是（干燥后的沉淀应该是，沉淀要充沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项注意事项：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无孵箱中过度干燥以防无法溶解。法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇

6、残留，沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因。判断判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样：透明胶样干燥后应该无色透明干燥后应该无色透明9 9）RNA RNA的溶解：用加样器吸取冰冷的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 20-3020-30 l l，加到，加到RNARNA上，反复吹打溶解上，反复吹打溶解RNARNA沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA应置冰上

7、保存应置冰上保存。1010)吸出吸出 2-32-3 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用(将用于将用于电泳电泳)。1111)剩余溶液放到冰上备用剩余溶液放到冰上备用 （将用于（将用于RTRTPCRPCR）。）。v注意：注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心沉淀的溶解一定要耐心充分，充分，一定一定要用加样器要用加样器反复反复多次吹打方多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响现气泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体流动

8、不拐弯吹打时液体流动不拐弯为止。为止。将将 RNA 进行进行 1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品样品 23 l 上样液轻轻混匀，上样液轻轻混匀，上样上样 电泳电泳:120伏，伏，1020分钟分钟 注意注意:电泳槽的清洁及新的电泳液！电泳槽的清洁及新的电泳液！琼脂糖凝胶要新鲜配制！琼脂糖凝胶要新鲜配制！紫外透射仪观察电泳结果紫外透射仪观察电泳结果RNA电泳结果电泳结果 rRNA可以作为内部可以作为内部Marker分分子，通过观察子，通过观察rRNA的两条带的两条带（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判断所提取断所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。RNA电泳并

9、不能判断电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因提取质量的常规方法，因为为在电泳过程中在电泳过程中RNA可能发生可能发生降解降解。RNA纯度的判断 280、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白质、苯酚的污染 2.2表明RNA已经水解成单核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物污染免疫组化的原理及流程介绍免疫组化的原理及流程介绍2015-07-21 主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.

10、免疫组化的原理免疫组化的原理二二.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程三三.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析免疫组化的原理免疫组化的原理 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍直接法直接法Tissue AntigenLabeled Antibody 将荧光、酶直接标记在一抗上优点：简单方便缺点：灵敏度低 每种一抗都需要进行标记 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍直接法直接法间接法间接法Tissue A

11、ntigenPrimary AntibodySecondary Antibody 将荧光、酶等标记在二抗上优点：灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍间接法间接法免疫组化SP法SPSP法法-链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白-过氧化物过氧化物酶法酶法（streptavidin-peroxidase）一抗一抗生物素标记的二抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRPStreptavidin-HRP（HRPHRP标记的链霉亲和素）标记的链霉亲和素）简化实验步骤 减少非特异性背景免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化SP法

12、 ABC ABC法法(Avidin Biotin-peroxidase Complex)一抗一抗生物素标记的二抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRP ComplexAvidin-Biotin-HRP Complex（亲和素（亲和素-HRP-HRP标记的生物素）标记的生物素）v 亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。v 一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。v 大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。免疫组化ABC法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化ABC法三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组

13、化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴抗原修复、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 4.4.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 2.2.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发他试剂能够充分与组织中抗原等

14、结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。景着色。1)60 20 minXylene：2 10 minutes；2)100%absolute ethanol：2 5 minutes；3)95%ethanol 2 minutes；4)80%ethanol 2 minutes；5)70%ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧

15、化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫组化反应结果容易受到法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进

16、行灭活。过氧化氢等进行灭活。1)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min30 min（RT RT 避避光）。光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原决

17、定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。胰酶修复。抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法:酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原

18、胞内抗原应用高频电磁波应用高频电磁波打开蛋白质间的打开蛋白质间的交联键交联键免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将切片放入将切片放入 0.01 M 0.01 M 柠檬酸钠缓冲柠檬酸钠缓冲 溶液（溶液（pH6.0pH6.0）后，在微波炉里高火）后，在微波炉里高火 4 min 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温，至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约再加热，约4 4次，每次间隔补足液体，次，每次间隔补足液体，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程

19、介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一的位点可以与一抗抗非特异性结合非特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假假阳性阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。组织中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干,用组化用组化笔在组织周围画上圈笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊羊血清（与二抗来源一致

20、）后放入湿盒中血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温 (约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。合与否用肉眼是看不出来的。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：一抗孵育温度有几种：4 4度、室温、度、室温、3737度，度，其中其中4

21、 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般体浓度有关，一般3737度度1-2h1-2h，然后，然后4 4度过夜和度过夜和从冰箱拿出后从冰箱拿出后3737度复温度复温45min45min。具体条件还要。具体条件还要摸索。摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原使抗原抗体结合更稳定。抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后

22、，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记检测出的标记(如带荧光、放射性、化如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。学发光或显色基团），作用是检测一抗。二抗孵育条件：二抗一般室温或二抗孵育条件：二抗一般室温或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要摸

23、索。，具体时间需要摸索。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。孵育时间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 min5 5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入稀释的二抗后放入 3737恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体

24、操作：具体操作：7.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即链霉素抗生物素蛋白染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合而后再结合POPO基。基。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1）加入加入 SP SP 复合液后放入复合液后放入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。灵

25、敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显）法中，显色剂为色剂为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB

26、100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。振洗，在放入氨水中返蓝即可。1)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用

27、双蒸水洗 5 min5 min；加；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染蛋白染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min5 min，再，再用用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明：透

28、明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的

29、位置。阳性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，液前甩干洗涤液，但又防止干片但又防止干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min20 min，立即放入新鲜，立即放入新鲜的的 二甲苯中；二甲苯中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一

30、抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中性及弱硷性条件（中性及弱硷性条件（PH7-8PH7-8）有利）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。于分解。4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。结合的物质。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢