宏基因组功能基因筛选课件.pptx
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- 关 键 词:
- 宏基 功能 基因 筛选 课件
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1、宏基因组功能基因的筛选宏基因组功能基因的筛选WCX2019年年3月月17日日目目 录录v宏基因组简介宏基因组简介v宏基因组的常用研究方法宏基因组的常用研究方法 16S(18S)rDNA测序测序 宏基因组文库宏基因组文库 功能基因筛选(策略一)功能基因筛选(策略一)v宏基因组的测序宏基因组的测序 功能基因筛选(策略二)功能基因筛选(策略二)宏基因组(宏基因组(Metagenome)Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于及其研究组于2019年提出,定义为年提出,定义为“the Genomes of the Total M
2、icrobiota Found in Nature”,即指即指任何特定环境样品中全部微生物任何特定环境样品中全部微生物遗传物质的总和遗传物质的总和,并且目前主要是指环境样品中细并且目前主要是指环境样品中细菌和真菌基因组的总和。菌和真菌基因组的总和。Metagenome VS Genome目目 录录v宏基因组简介宏基因组简介v宏基因组的常用研究方法宏基因组的常用研究方法 16S(18S)rDNA测序测序 宏基因组文库宏基因组文库 功能基因筛选(策略一)功能基因筛选(策略一)v宏基因组的测序宏基因组的测序 功能基因筛选(策略二)功能基因筛选(策略二)Metagenomics involves co
3、nstructing DNA libraries from environmental DNAConstruct 16S(18S)rRNA gene library using PCRsequenceEnvironmental sampleClone into vectoreg plasmid,cosmid phosmid,BACIntroduce into host eg E.coliE x t r a c t m e t a g e n o m i c DNAMetagenomic libraryScreen for specific sequences by PCR or hybridi
4、sationSIGEX16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对分子的对应的应的DNA序列,也就是序列,也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为的编码基因。其长度大约为1500 bp通过通过16S rDNA的测序,可以分析环境的群落构成,以及进行细的测序,可以分析环境的群落构成,以及进行细菌的分类和进化分析。菌的分类和进化分析。细菌细菌16S rRNA的测序分析的测序分析uAshelford 等(等(2019)通过对)通过对4383个细菌个细菌16S rDNA的序列的序列进行比对分析,表明进行比对分析,表明16S rDNA 全长序
5、列中包含全长序列中包含9个可变区个可变区(V1-V9)和)和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲缘关系,可变区则表明物种间的差异。缘关系,可变区则表明物种间的差异。uChakravorty 等(等(2019)总结)总结16S rDNA 的序列,及其中的序列,及其中九个九个9个可变区和个可变区和10个保守区的位置和长度,并指出不同的个保守区的位置和长度,并指出不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3(约(约60 bp)和)和V6区(约区(约70 bp)可以分别用来鉴定大多数细菌。)可以分别用来鉴定大多数细菌。细菌细
6、菌16S rRNA的的V3或或V6区的测序分析区的测序分析16S rDNA 通过设计特异的通过设计特异的PCR引物,扩增得到引物,扩增得到V3或或V6区的序列,然区的序列,然后两端加上接头,便可利用后两端加上接头,便可利用Illumilla的高通量测序技术对的高通量测序技术对V3或或V6区进行测序分析,以获得环境样品中细菌等物种分类、物区进行测序分析,以获得环境样品中细菌等物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。真菌真菌ITS的高通量测序分析的高通量测序分析ITS(Internal Transcribed Spacers),即
7、核糖体内转录间隔区,即核糖体内转录间隔区,是位于是位于 28S rDNA的的3端与端与 18S rDNA的的 5端之间的序列端之间的序列ITS常用于真菌的分类研究,其长度一般为常用于真菌的分类研究,其长度一般为650-750 bpITS包含包含ITS1和和ITS2两个区域。其中两个区域。其中ITS1 位于位于 18S rDNA和和 5.8S rDNA之间,之间,ITS2位于位于 5.8S rDNA和和 28S rDNA之间之间 ITS 1 和和ITS 2 是中度保守区域是中度保守区域,其保守性基本上表现为种内相对一致其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。种间差异比较明显。IT S
8、 的序列分析能实质性地反映出属间、的序列分析能实质性地反映出属间、种间种间以及菌株间的碱基对差异以及菌株间的碱基对差异,此外此外ITS 序列片段较小、序列片段较小、易于分析易于分析,目前已目前已被广泛应用于这种特点使被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。通过设计特异的通过设计特异的PCR引物,扩增得到引物,扩增得到ITS序列,然后两端加上接头,便可利序列,然后两端加上接头,便可利用用Illumilla的高通量测序技术对的高通量测序技术对IT
9、S进行测序分析,以获得环境样品中真菌进行测序分析,以获得环境样品中真菌等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。宏基因组文宏基因组文库库Metagenomic Library通过通过PCR PCR 或者杂或者杂交筛选特定序列交筛选特定序列通过功能筛选特通过功能筛选特定表型的阳性克定表型的阳性克隆隆环境样品环境样品抽提抽提DNA 克隆克隆(多种载体多种载体)转化适宜宿主细菌转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌如大肠杆菌)宏基因组文库的构建宏基因组文库的构建 宏基因组文库的分析宏基因组文库的分析SIGEXSIGEX基于宏
10、基因组分离基于宏基因组分离筛选功能基因筛选功能基因的四的四个技术要素个技术要素载体载体 Vector宿主宿主Host自然产品筛选平台自然产品筛选平台Natural Product Discovery Platform环境样品环境样品DNA制备制备DNA Preparation高通量筛选高通量筛选High Throughput Screening 环境样品环境样品DNA制备制备 原位裂解法原位裂解法:将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理:将土壤样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理,继而抽提纯继而抽提纯化。化。此法操作容易、成本低、此法操作容易、成本低、DNA提取率高、偏差小提取率高、偏差小,但由于强烈
11、的但由于强烈的机械剪切作用机械剪切作用,所提取的所提取的DNA片段较小片段较小(1-50 kb),且腐殖酸类物质也,且腐殖酸类物质也难以完全去除。难以完全去除。异位裂解法异位裂解法:采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来采用物理方法将微生物细胞从土壤中分离出来,然后采然后采用较温和的方法抽提用较温和的方法抽提DNA,如先采用尼可登介质密度梯度离心分离如先采用尼可登介质密度梯度离心分离微生物细胞微生物细胞,然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解,脉冲场凝胶电泳回收脉冲场凝胶电泳回收DNA。可获得大片段可获得大片段DNA(20500 kb)且纯度高且纯度高,但操作繁琐但操作繁琐
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