实验3抗体制备补体结合PBMC分离课件.ppt

1、 实验三实验三1.1.补体结合反应补体结合反应2.2.人外周血单个核细胞分离人外周血单个核细胞分离3.3.抗体制备抗体制备(3)(3)Test 1 补体结合反应补体结合反应（Complement fixation Test,CFT）补体结合位点补体结合位点Fab段段Fc段段C1q 结合结合位点被屏位点被屏障障结合抗原之前结合抗原之前 CH1 CH2暴露的暴露的C1q结结合位点合位点结合抗原之后结合抗原之后IgM CH3区，区，IgG CH2区区Ag+AbAg+AbBinding to ComplementAg+Ab+CAg+Ab+CActivation of Activation of Com

2、plementComplementLysis of target Lysis of target cellscells概念：概念：补体结合反应：补体结合反应：是指在是指在补体补体的参与下，以绵羊红细胞（的参与下，以绵羊红细胞（SRBCSRBC）和溶血素（抗）和溶血素（抗SRBCSRBC的抗体）作为的抗体）作为指示指示系统系统的的抗原抗体反应抗原抗体反应。补反中包括补反中包括两个系统两个系统五种成分：五种成分：待检系统：已知待检系统：已知AgAg或或AbAb、待检、待检AbAb或或AgAg及及仅供一组仅供一组Ag-AbAg-Ab系统反应的定量补体。系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素

3、。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：原理：1 21 12 21 12 21：No Ab；2：AbAg待测血清待测血清 AbAb阳性阳性No AbNo Ab阴性阴性AgAgAg 抗原：伤寒菌裂解产物抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：待测血清：5656，30min30min 补体：豚鼠血清补体：豚鼠血清 2%2%绵羊红细胞绵羊红细胞 溶血素溶血素材料：材料：方法：方法：123450.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 摇匀，摇匀，3737，水浴，水浴15mi

4、n15min（1 1份份/2/2人）人）预期结果：预期结果：1 1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。明呈红色为溶血。溶血溶血不溶血不溶血2.2.试验管试验管血清对照管血清对照管抗原对照管抗原对照管补体对照管补体对照管SRBCSRBC对照管对照管？溶血溶血溶血溶血溶血溶血不溶血不溶血 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。注意事项：注意事项：Test 2 人外周血单个核细胞分离人外周血单个核细胞分离1.密度梯度离心法 粒细胞和红细胞(1.092g/l)分离液(1.0770.002g/l)淋巴细胞单核细胞1.0

5、70g/l血浆层外周血淋巴细胞分离液离心2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hanks液混匀取3ml稀释血，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中2000rpm，离心20min小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hanks液2000rpm，离心10min弃上清，加入2ml Hanks液2000rpm，离心10min弃上清，加入2ml Hanks液细胞计数RBCWBCWBCWBCWBC1mm1mmCell concentration/ml=Total cell count in 4 squares/4 x 104Cell concentration/ml=Total cell count in 5 squares x 5 x 104注意 无菌操作无菌操作.注意血制品污染注意血制品污染.控制操作时间，保持细胞存活控制操作时间，保持细胞存活.应用水平离心机应用水平离心机.E-花环形成实验花环形成实验 用于检测外周血T细胞的数量和比例.TTBSRBCCD2结果E-花环形成率 形成花环的淋巴细胞数=淋巴细胞总数(形成和未形成花环的细胞总数)正常范围:60-80%X 100%淋巴细胞增殖实验外周血或分离的淋巴细胞PHA涂片染色共培养形态学观察计算转化率Test 3 抗体制备抗体制备方法方法: