临床基因扩增检验操作规范课件.ppt

1、临床基因扩增检验操作规范一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能规范化设置及其各室的功能一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其 1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有 各室功能：（一）试剂贮存和准备区（一）试剂贮存和准备区（一）试剂贮存和准备区 功能：含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应（二）标本制备区（二）标本制备区（二）标本制备区 功能：要正确使用加样器。（三）扩增区（三）扩增区（三）扩增区 功能：已制备的D N A 模板和合成的c D N A 的（四）扩增产物分析区（四）扩增产物分析区（四）扩增产物分析区 功能

2、：膜上微孔板上探针杂交方法、S o u t二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求 测定分析前的标本采（一）标本的采集（一）标本的采集（一）标本的采集 临床标本包括E D T A（二）标本的稳定化处理（二）标本的稳定化处理（二）标本的稳定化处理 D N A：不需特殊稳定化处理。（三）标本的运送（三）标本的运送（三）标本的运送 可在常温下通过邮寄运（四）标本的贮存（四）标本的贮存（四）标本的贮存1.血清/血浆等-7 0 （五）标本的处理（核酸提取）（五）标本的处理（核酸提取）（五）标本的处理（核酸提取）抑制物可能来源于：操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）（六）靶核酸的逆转录（六）

3、靶核酸的逆转录（RT）和扩增和扩增（六）靶核酸的逆转录（R T）和扩增 有多R T-P C R 操作注意：标本必须新鲜；（七）扩增产物的分析（七）扩增产物的分析（七）扩增产物的分析 扩增产物的测定有实时荧光定量PCR实时荧光定量P C R 在荧光定量P C R 基础上实时监测P C R 全过程TaqMan荧光定量荧光定量PCR原理原理T a q Ma n 荧光定量P C R 原理探针两端分别用荧光基团和淬灭临床基因扩增检验操作规范课件临床基因扩增检验操作规范课件三、三、PCR污染与对策污染与对策三、P C R 污染与对策P C R 污染分环境污染与反应液污染二种。常要防止P C R 污染，必须

4、做好以下3 个环节的工作：（一）污染的预防（一）污染的预防（一）污染的预防操作P C R 时，按照下述规则可有效地预防P C R3、改进实验操作：（二）污染源的追踪1、阳、阴性对照、阳、阴性对照1、阳、阴性对照2、常见的环境污染源有、常见的环境污染源有 2、常见的环境污染源有(1)点杂交的点样器；追踪可疑的环境污染源追踪可疑的环境污染源追踪可疑的环境污染源 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分（三）污染源的处理1.环境污染处理法环境污染处理法1.环境污染处理法（1）稀酸处理法。2.反应液的污染处理法反应液的污染处理法2.反应液的污染处理法(1)D N a s e I 法：(2)内切酶法：(4)尿

5、嘧啶D N A 糖基化酶（U N G）法：T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热加热 A A A PCR临床基因扩增检验操作规范课件该法优点：四、因操作欠规范导致的问题分析（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳移液器：严禁大力来回拧动；离心机：离心前，离心管须配平；（二）实验室布局不合理引起的污染问题（二）实验室布局不合理引起的污染问题（二）实验室布局不合理引起的污染问题1、样品处理不进行隔离，（三）（三）PCR操作中存在问题分析操作中存在问题分析（三）P C R 操作中存在问题分析1.阳性变阴性1.阳性变阴性阳性变阴性1.阳性变阴性(1)有些阳性病人，经过P C R 检测后为阴(2)标本保存不当，可引起P C R 失败。2.阴性变阳性 加入试剂或样品时引起的交叉污染加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤 打开标本管盖引起样品飞溅不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染3.P C R 检测结果不稳定（2）操作不当带来的后果5 0 l 血清标本 1 4 0 0 0 r/mi n 离心5 mi n 取上清8 0 1 0 0 l 在痰标本处理时液化是十分重要的，痰没谢谢！谢谢！