临床免疫测定技术课件.ppt
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1、临床免疫测定技术(各论)临床免疫测定技术课件1凝集试验凝集试验Widal reactionWidal reactionWeil-felix reactionWeil-felix reactionWright test:Wright test:布鲁菌病布鲁菌病交叉配血试验交叉配血试验临床免疫测定技术课件相关帮助相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库,其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成,以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体
2、搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的,可以访问探生网biomean进行咨询,期待您的加入临床免疫测定技术课件Widal reactionWidal reaction(试管内凝集反应)(试管内凝集反应)取:取:(1 1:1010)待)待检血清检血清3.0ml3.0ml 生理盐水生理盐水 3.0ml/3.0ml/管管 l 释度释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:6401:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 临床免疫测定技术课件
3、待测血清的待测血清的抗体效价抗体效价(滴度):(滴度):即出现即出现“+”“+”凝集的最终血清稀释度凝集的最终血清稀释度临床免疫测定技术课件血型鉴定(玻片凝集反应)(直接)血型鉴定(玻片凝集反应)(直接)YYY+抗抗A A标准血清标准血清YYY+抗抗B B标准血清标准血清 待测待测RBCRBC待测待测RBCRBCA A型型 B B型型临床免疫测定技术课件 乳胶凝集试验乳胶凝集试验(间接间接)带现象带现象Zone Zone phenomenonphenomenon前带前带prezoneprezone后带后带postzonepostzone临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件 1 1)正向间接
4、凝集试验)正向间接凝集试验 (用抗原致敏载体用抗原致敏载体-检测检测Ab)Ab)2 2)反向间接凝集试验)反向间接凝集试验间接凝集间接凝集(用抗体致敏载体用抗体致敏载体-检测检测AgAg)3 3)间接凝集)间接凝集抑制抑制试验试验 4)4)协同凝集试验协同凝集试验 (SPA (SPA抗体致敏抗体致敏-测抗原测抗原)临床免疫测定技术课件 反向间接血凝试验反向间接血凝试验(测测Ag)Ag)1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678临床免疫测定技术课件抗球蛋白抗抗球蛋白抗体
5、试验体试验-commbscommbs (抗(抗RBCRBC不完不完全抗体)全抗体)A A(间接法(间接法游离)游离)B B(直接法(直接法结合):结合):临床免疫测定技术课件(In fluid phase)(In fluid phase)絮状沉淀试验:絮状沉淀试验:AgAgAbAb环环状状沉沉淀淀试试验验临床免疫测定技术课件(In gel phase)(In gel phase)single gel diffusion testsingle gel diffusion test 抗原浓度的抗原浓度的标准曲线标准曲线操作:操作:抗体抗体混于凝胶中混于凝胶中 抗原抗原加入孔内加入孔内 抗原自由扩散
6、抗原自由扩散 测定沉淀环直径测定沉淀环直径 在标准曲线上查找在标准曲线上查找 相应抗原浓度相应抗原浓度临床免疫测定技术课件1.1.抗原分子量:与扩散速度、沉淀环反相关抗原分子量:与扩散速度、沉淀环反相关2.2.抗体种类:兔抗血清优于马、羊抗体种类:兔抗血清优于马、羊3.3.抗体稀释度:抗体浓度大沉淀环小抗体稀释度:抗体浓度大沉淀环小4.4.扩散时间:抗原含量高,扩散时间长扩散时间:抗原含量高,扩散时间长5.5.扩散温度:扩散温度:4 43737内温度与扩散速度正相内温度与扩散速度正相关关6.6.琼脂板厚度:与沉淀环反相关琼脂板厚度:与沉淀环反相关临床免疫测定技术课件double gel dif
7、fusion testdouble gel diffusion test原理原理:将将可溶性抗原可溶性抗原和和抗体抗体置于置于琼脂凝胶板的对应孔中,琼脂凝胶板的对应孔中,两者各自在凝胶中向四周两者各自在凝胶中向四周自由扩散,当抗原与抗体自由扩散,当抗原与抗体相遇相遇,在,在比例合适比例合适时形成时形成沉淀沉淀线线。临床免疫测定技术课件琼脂双向扩散试验的琼脂双向扩散试验的应用应用1.1.检测未知抗原或抗体检测未知抗原或抗体2.2.抗原性质分析抗原性质分析 3.3.抗体效价滴定抗体效价滴定4.4.抗原或抗体纯度鉴定抗原或抗体纯度鉴定临床免疫测定技术课件1.1.检测未知抗原或抗体检测未知抗原或抗体临
8、床免疫测定技术课件A:A:浓度浓度AgAg、AbAb及扩散率近似;及扩散率近似;B B:浓度:浓度AgAg、AbAb近似,扩散率近似,扩散率AgAgAb Ab;C C:浓度:浓度AgAg、AbAb近似,扩散率近似,扩散率AgAgAbAbD D:浓度:浓度AgAgAbAb,扩散率近似;,扩散率近似;E E:浓度:浓度AgAgAbAb,扩散率,扩散率AgAgAb Ab;F F:浓度:浓度AgAgAbAb,扩散率,扩散率AgAgAb Ab;临床免疫测定技术课件2.2.抗原性质分析抗原性质分析临床免疫测定技术课件3.3.抗体效价滴定抗体效价滴定临床免疫测定技术课件4.4.抗原或抗体纯度鉴定抗原或抗体纯
9、度鉴定临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件年年 龄龄 IgG IgA IgM IgG IgA IgM脐血脐血 6.5 6.516.0 0.0116.0 0.010.04 0.04 0.250.251 1月月 2.5 2.59.0 0.029.0 0.020.5 0.200.5 0.200.80.82 29 9月月 2.0 2.09.0 0.049.0 0.040.8 0.250.8 0.251.01.010101212月月 2.9 2.910.7 0.1510.7 0.150.9 0.350.9 0.351.51.51 15 5岁岁 3.4 3.412.4 0.1512.4 0.151.6
10、 0.451.6 0.452.02.06 61212岁岁 6.5 6.516.0 0.3516.0 0.352.5 0.502.5 0.502.52.512126060岁岁 6.5 6.516.0 0.4016.0 0.403.5 0.503.5 0.503.03.0 健康人血清健康人血清IgIg含量(含量(g/Lg/L)临床免疫测定技术课件 免疫固定电泳(测免疫固定电泳(测M蛋白)蛋白)临床免疫测定技术课件CH50(complement CH50(complement hemolysis 50%).hemolysis 50%).原理:组分和功能完整原理:组分和功能完整的补体系统能使抗体致的补
11、体系统能使抗体致敏的羊红细胞(敏的羊红细胞(SRBCSRBC)发生溶血反应。在一定发生溶血反应。在一定范围内,范围内,SRBCSRBC溶血程度溶血程度与补体总活性成正相与补体总活性成正相关。以溶血百分率作纵关。以溶血百分率作纵坐标,相应的血清量为坐标,相应的血清量为横坐标绘图,在一个适横坐标绘图,在一个适当的、稳定的反应体系当的、稳定的反应体系中,溶血程度与补体剂中,溶血程度与补体剂量依赖呈一个量依赖呈一个S S形曲线形曲线 临床免疫测定技术课件Enzyme linked immunosorbent assayEnzyme linked immunosorbent assay (ELISAEL
12、ISA)原理(原理(PrinciplePrinciple):将抗原或抗体结合到:将抗原或抗体结合到某固相载体表面,保持其免疫活性,测定时某固相载体表面,保持其免疫活性,测定时,把被测把被测samplesample和和conjugateconjugate按不同的步骤与固按不同的步骤与固相载体上的相载体上的immunosorbentimmunosorbent反应。用洗涤的方反应。用洗涤的方法使与固相载体上形成的法使与固相载体上形成的immunocompleximmunocomplex与其与其他物质分开,再加入酶反应他物质分开,再加入酶反应substratesubstrate,经酶,经酶的催化作用后
13、的催化作用后substratesubstrate变为有色产物。产物变为有色产物。产物的量与标本中被检物的量直接相关。的量与标本中被检物的量直接相关。临床免疫测定技术课件ELISAELISA操作的基本步骤:操作的基本步骤:标本的收集、运送和保存标本的收集、运送和保存试剂准备试剂准备加样加样温育温育洗板洗板显色显色比色比色结果判断结果判断结果报告及解释结果报告及解释临床免疫测定技术课件1 1、标本的收集、运送和保存、标本的收集、运送和保存ELISAELISA检测分析用检测分析用标本标本 血清(浆)血清(浆)特殊项目用:特殊项目用:唾液、脑脊液、尿液、粪便等唾液、脑脊液、尿液、粪便等ELISAELI
14、SA检测分析的检测分析的对象对象 病原体抗原病原体抗原/抗体抗体 Tumor mark Tumor mark、hormonehormone、cytokine et alcytokine et al采集、运送与保存的注意点:采集、运送与保存的注意点:采集时间、运送条件、暂存点温度采集时间、运送条件、暂存点温度临床免疫测定技术课件可能影响测定结果的标本因素可能影响测定结果的标本因素一、内源性(标本内)一、内源性(标本内)类风湿因子(类风湿因子(rheumatoid factorrheumatoid factor)补体(补体(complementcomplement)异嗜性抗体(异嗜性抗体(hete
15、rophilic antibodyheterophilic antibody)治疗或诊断用鼠抗体(抗鼠抗体)治疗或诊断用鼠抗体(抗鼠抗体)自身抗体或溶菌酶等自身抗体或溶菌酶等二、外源性(操作)二、外源性(操作)溶血、反复冻融溶血、反复冻融 细菌污染细菌污染 储存时间过长储存时间过长 标本凝固不全标本凝固不全临床免疫测定技术课件对策:对策:1 1、稀释标本、稀释标本 2 2、改变选用的酶标抗体、改变选用的酶标抗体 3 3、预封闭(变性、预封闭(变性IgGIgG)4 4、加入某些还原剂、加入某些还原剂 5 5、血清标本的补体灭活(、血清标本的补体灭活(5630min5630min)6 6、选择包被
16、或标记抗体如、选择包被或标记抗体如F(ab)F(ab)2 2片段片段 7 7、用理化方法解离自身抗体、用理化方法解离自身抗体 8 8、标本中添加、标本中添加CuCu2+2+离子或卵白蛋白离子或卵白蛋白 等等等等临床免疫测定技术课件 2 2、试剂准备、试剂准备1 1、实验开始前,将试剂盒从冰箱取出置室、实验开始前,将试剂盒从冰箱取出置室温放置温放置20min20min以上启用,谓平衡(以上启用,谓平衡(balancebalance)目的:目的:1 1)保证反应温度的一致性)保证反应温度的一致性 2 2)去湿化,保证试剂浓度)去湿化,保证试剂浓度2 2、稀释液的质量和特殊试剂配制的要求、稀释液的质
17、量和特殊试剂配制的要求临床免疫测定技术课件3 3、加样、加样原则:量准原则:量准 操作规范操作规范量准量准移液枪的状态与正确使用移液枪的状态与正确使用操作规范操作规范 正确使用加样器正确使用加样器临床免疫测定技术课件3 3、加样、加样操作规范操作规范 掌握操作要领掌握操作要领 吸头与加样器上吸头套密闭吸头与加样器上吸头套密闭 吸头进入液体的深度要适宜吸头进入液体的深度要适宜 放送液体注意角度(放送液体注意角度(10104040)位置(下位置(下1/31/3)速度(不宜太快)速度(不宜太快)关注加样器的状态关注加样器的状态临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件4 4、温育(、温育(incuba
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