elisa免疫测定课件.ppt

1、ELISA检测检测技术要点与常见问题技术要点与常见问题ELISAELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassayimmunoassay，IAIA）。基础。基础:抗原抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。抗原抗体反应抗原抗体反应 可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是

2、一种动态平衡，其反应式为：平衡，其反应式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高亲高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。能保持原有的结构和活性。特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决

3、定簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。最适比例最适比例 敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/

4、mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。正常血清中所含的高浓正常血清中所含的高浓小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化对照设定对照设定 u 阳性对照品 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。u 阴性对照品 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。ELISAELISA操作中的注操作中的注,果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等交叉反应物质和其他物质等试剂准备试剂准备加样加样保保 温温时间。时间。结果判定结果判定（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值。值。酶标仪单、双波长酶标仪单、双波长定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，减少实验误差。减少实验误差。的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原。P24抗原的检测，把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板，可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。RPR主要用于治疗效果的监测。呈膜状延展（+）