第章基因工程课件.ppt

1、第十四章第十四章 Genetic Recombination and Genetic EngineeringXiu-feng GaoWest China School of Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University一、自然界的基因转移和重组：接合作用，转化、转导作用，噬菌体DNA的整合,细菌的特异位点重组，转座重组，同源重组，插入序列的结构特点，转座子的结构特点。二、重组DNA技术 相关概念：克隆，基因工程,工具酶,目的基因,基因载体 基本原理和过程：目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,重组DNA的导入,重

2、组体的筛选,克隆基因的表达。主要内容第一节 细菌的基因转移和重组Bacterial Gene Transfer and Recombination1.接合作用（conjugation）当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移到另一个细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用。质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子一、细菌的基因转移F factor:含有细菌性鞭毛蛋白的编码基因.F-F+F+F+F+F-接合转移F+42 转化作用（transformation）通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。例：

3、溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。溶菌溶菌摄取重组溶菌生长途径(lysis pathway)：噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA在宿主内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，溶解细菌，释放出新生噬菌体。溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)：噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA整合进宿主染色上，随宿主复制而复制。当遇到DNA损伤时，噬菌体（原噬菌体）从宿主菌（溶原菌）染色体上脱下来，进入溶菌生长途径。溶菌感染重组溶菌细菌噬菌体3.转导作用（transduction）3.转导作用（转导作用（transduction）当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，

4、发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。感染感染重组溶菌细菌二、二、DNA重组重组(DNA recombination)同源重组(homologous recombination)特异位点重组(site-specific recombination)定义：不同DNA分子间发生的共价连接或DNA分子内较大片段的交换称为重组或重排。转座重组(transposition recombination)自然界的基因转移和重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的

5、交换，又称为基本重组。是最基本的DNA重组方式:以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制。（一）同源重组（一）同源重组9 内切酶内切酶(RecBCD)DNA侵扰侵扰(RecA)分支迁移分支迁移 (RecA)内切酶内切酶(RecBCD)DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 10Holiday中间体中间体5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3

6、3 3 3 内切酶内切酶(RuvC)内切酶内切酶(RuvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体5 3 5 3 5 3 5 3 ABCDC5 5 5 5 3 3 3 3 ABD5 5 5 5 3 3 3 3 ACBD11同源重组关键步骤 同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口；两个单链对接，形成半交叉；半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA；形成Holliday中间体，Holliday中间体的变构和拆分。片段重组体(patch recombinant)切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，

7、其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体(splice recombinant)切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。（二）位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。整合酶(intergrase,Int)：是噬菌体DNA编码的产物，是一种DNA结合蛋白，对噬菌体的的重组位点attP有强的结合力，催化attP和细菌重组位点attB之间的重组。整合宿主因子(intergration host factor,IHF):细菌编码的产物。切离酶(Xis):噬菌DNA编码的产物.1.噬

8、菌体DNA的整合13噬菌体噬菌体DNA细菌细菌DNAPOPBOBattPattBIntIHFPOPBOBBOPPOBIntIHF，Xis噬噬菌菌体体DNADNA的的整整合合2.细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位导致鞭毛相转变导致H1抗原和H2抗原的交替表达H2H1rH1PPPhixhixhinPH2 鞭毛蛋白 阻遏蛋白H2H1rH1PPPhixhixhinPH1 鞭毛蛋白H片段片段H片段片段15 H片段有两个特异重组位点（hix）为反向重复序列 H片段上有两个启动子P 其一驱动hin基因表达 H片段可在Hin和Fis控制下进行特异位点 重组(倒位)。另一正向时驱动H2和rH1基因表达 rH1

9、为H1的阻遏蛋白基因。H片段反向(倒位)时H2和rH1不表达，H1表达。H片段倒位导致鞭毛相转变要点 163.3.免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C RSSRSSRSS17重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence,RSS)。此

10、重排的重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重组信号序列切割位点(RAG2)RAG1位点18V片段片段J片段片段RSSRSS间插DNAOHOH单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目目 录录V片段片段J片段片段19（三）转座重组(transposition recombination)定义：由插入序列(insertion sequen

11、ces,IS）和转座子(transposons)介导的基因转移或重组。（1）IS转座 IS转座发生形式：保守性转座：IS由原位到新位。复制性转座：IS复制后，复制本迁到新位到，另一个留在原位。IS特征：IS两侧有二个分离的反向重复序列(inverted repeats,IR)一个转座酶（transposase)编码基因 IS插入靶位点的两侧产生正向重复序列（derect repeat,DR）IRTransposase GeneIRDRDRISATGCATACGT靶位点靶位点粘性末端切割TACGTATGCAATGCATACGTATGCATACGTATGCATACGTIS和靶位点共价连接复制修复缺

12、口形成DRIS保守性转座IRIRIRIRDRDRIS插入序列的复制性转座22 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基因（2）转座子转座2324重组DNA技术是对携带遗传信息分子进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。也就是人工操作基因的过程。实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。25一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆

13、(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）26 目的 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白）(DNA cloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。27（二）工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA

14、DNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基28限制性核酸内切酶(restriction end

15、onuclease,RE)型酶 型酶识别位点与切割位点不一致；没有固定的切割位点；不产生特异性片段；型酶识别位点是特异的；切割位点位于识别位点中或附近；产生特异性片段；是最常用的工具酶。功能：能特异水解双链DNA的磷酸二酯键。有特异切割位点；切割位点在识别位点以外；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株或型；用罗马数字表示发现的先后次序。Hind 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性核酸内切酶命名30限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,

16、RE)定义：是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。作用特点：识别序列有特异性；大多数识别位点具有回文结构 酶解后产生特征性切口 平端切口 5末端突出粘性末端切口 3末端突出粘性末端切口31形成特征性切口Sma平端切口CCCGGGCCCGGGGGGCCCGGGCCC53555333Bam HGCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G535553335末末端突出粘性末端CTGCAGCTGCAGGACGTC GACGTC 535553333末末端突出粘性末端Pst321.大多数酶是识别顺序不同，切割方式也不同。2.同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相

17、同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。Bam HBgl GGATCC CCTAGG GATCC GGCCTAG AGATCT TCTAGAATCTAG GATCT AGGATCTCCTAGAAGATCCTCTAGG333.同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst344.有些酶识别顺序相同，切割方式不同，产生不同的末端。CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaCCCGGGGGGCCCCC

18、CGGGGGGCCCXma（三）目的基因（三）目的基因 感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA（target DNA）或外源DNA.1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)1.化学合成法 将要合成的DNA片段3端的第一个核苷酸固定在固相载体上；加入第二个核苷酸进行缩合反应；清洗；进行循环反应；每次只能合成80 个碱基，超过此范围的就要分段合成。优点：合成速度快、准确性极高 适用：PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、小基因片段合成。组织或

19、细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子每个细菌都含一个重组DNA分子的多个拷贝限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。2.从基因组DNA文库获取目的基因目目 录录38限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR cosR cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos基因文库目 录cos L左臂20 Kb 外源 DNA 片段 393.从cDNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 c

20、DNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制逆转录酶AAAAAAAATTTTTTTT AAAAAAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 TTTT TTTT404.聚合酶链反应(PCR)94变性 5min55退火70引物延伸第一个循环第二循环25-30次循环后目的DNA可扩大100万倍template DNA（四）基因载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体：质粒DNA、病毒DNA、人工载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源D

21、NA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的克隆载体称为表达载体。421.质粒(plasmid)特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。43载体的选择标准 有自身复制子，在宿主细胞内能自主复制并能使目的DNA片段同步扩增；具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有可供选择的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；分子量尽量小，以容纳较大的外源DNA。考贝数要高 表达载体要具备使目的基因表达的完整转录单位是由一系列大肠杆菌质粒DNA经重组技术构建的克隆载体。1.有一个复制起点，能够独立复制；2.有很多单一酶切位点，可供目的基

22、因插入；3.有选择标记，氨苄和四环素的抗性基因；4.分子量小，4363bp，可以转化进入宿主.45 是由pBR322质粒与M13噬菌体的片段重组而成的dsDNA质粒，是最常见的克隆载体。a-互补：pUC质粒中的Lac Z基因编码b-半乳糖苷酶N-端的a片段，与宿主细胞编码的缺陷型b-半乳糖苷酶实现基因互补，合成完整的b-半乳糖苷酶.46 pUC质粒内来源于大肠杆菌的Lac Z基因，此基因能编码b-半乳糖苷酶N-端的a片段，可与宿主细胞缩编码的缺陷型的b-半乳糖苷酶实现基因互补（a 互补）能分解5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷（X-gal），形成兰色菌落。当外源基因插入Lac Z基因时，

23、宿主细胞不能合成完整的b-半乳糖苷酶，不能分解底物，为阳性菌落为白色，插入失败的为兰色（阴性）。这种筛选阳性重组子的方法称为蓝白斑筛选蓝白斑筛选2.2.噬菌体噬菌体(phage)(phage)头部蛋白质头部蛋白质 DNA+DNA+内部蛋白质内部蛋白质 尾环尾环 尾心尾心尾鞘尾鞘 尾盘尾盘 尾纤丝尾纤丝 48插入型载体：gt系列（适用cDNA克隆）置换型载体：EMBL系列（适用基因组克隆）常用的噬菌体载体噬菌体DNA：是双链DNA分子；基因组48.6kb；呈线状排列；两端有单链互补末端；进入宿主后环化。M13噬菌体：是环状单链DNA分子；只感染带有F-因子的细胞（JM101,JM103等）在宿主

24、内通过不对称复制形成M13颗粒构建的M13噬菌体载体 M13mp系列pUC系列粘性质粒(cosmid)有噬菌体DNA的cos位点；有整个pBR322的DNA序列；可容纳35-45kb的外源DNA；可以体外包装成噬菌体；在宿主内复制同质粒。常用的粘性质粒PJ88、PAC79、C2XB等51酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他52酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,

25、YAC）适用于克隆大片段DNA，0.2-2Mb。YAC 的主要功能成份着丝粒：mitosis姊妹染色单体分离之必需。端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。二、重组DNA技术基本原理及操作目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达551.粘性末端连接方式2.(1)同一限制酶切位点或配伍末端连接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAAT

26、TCG53AATTCGGCTTAA55AATTC GGCTTAA555533（三）外源基因与载体的连接外源基因经DNA连接酶催化形成嵌合DNA的过程。Bam H切割 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶,15CGATCC GGCCTAG目的基因用 Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连目

27、的基因自连同一限制酶切位点连接57(2)不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点Bgl 切割位点EcoR+Bgl 双酶切Eco R+Bgl 双酶切T4 DNA连接酶,15C重组体GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAATCTAGAATTCG58CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R（3）人工接头连接 在平端载体或DNA片段加上新的酶切识别位点，酶切后可产生新的粘性末端。（4）同聚物加尾连接 在末端转移酶的作用下，在DNA末端加上同聚物序列，制造出粘

28、性末端，效率较高。59目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因自连载体(5)平端连接限制性内切酶切割产生的平端;粘端补齐或切平形成的平端，效率较低。60受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)：外源DNA（质粒导入细菌的过程。转染(transfection)：以噬菌体为载体构建的重组子导入细胞的过程。（四）重组DNA导入受体菌61（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹 2.2

29、.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等62(插入失活法)抗药性标记选择目目 录录63组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成DNADNA重组体标志补救标志补救64插入目的基因利用 互补原理筛选重组体含有 5-溴-4-氯-3-吲哚b-D-半乳糖苷（X-gal）和Lac 操纵子诱导剂的培养基b-半乳糖苷酶N-端的a片段b-半乳糖苷酶C-端的a片段b-半乳糖苷酶C-端的a片段65显影或显色将核酸固定到膜上分子杂交法菌落印迹原位杂交斑点印迹杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交将菌落或噬菌斑印迹到膜上提取DN

30、A或RNA提取DNA提取RNA裂解细菌或噬菌体变性DNA或RNA琼脂糖凝胶电泳变性DNA将核酸点到膜上将核酸转移到膜上预杂交（消除非特异性吸附）加入标记的探针杂交菌菌落落印印迹迹原原位位杂杂交交67SouthernSouthern印迹印迹68鸡的肌球蛋白的克隆和检出目目 录录免疫学方法69 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程70重组DNA技术操作过程小 结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 71重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化转染宿主筛选表型筛

31、选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成 PCR产物表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达731.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）原核表达载体的标准选择标志：便于重组子的筛选强启动子：能调控转录翻译调控序列：SD序列，翻译起始点多接头多克隆位点：定向插入外源DNAE.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体，很难表达大量可溶性蛋白74优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不

32、经济转染 将表达载体导入真核细胞的过程。方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞75基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。（一）基因诊断（一）基因诊断三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。76 （三）重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促

33、进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(a 1b,a2a,a 2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱771.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性（五）遗传疾病的预防78pET30b质粒图谱质粒图谱pET30b多克隆位点多克隆位点SDS-PAGEM 1 1 2 3 MM:Marker1:重组菌重组菌2：空质粒：空质粒3：BL21