基因工程制药课件.ppt

1、基因工程制药2.DNADNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立双螺旋结构和半保留复制机理的建立 19531953年，沃森年，沃森(Watson(Watson）和克里克和克里克 （CrickCrick）首次提出首次提出了了DNADNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大地促进了现代生物科学的发展。地促进了现代生物科学的发展。3.3.遗传信息传递方式的确立遗传信息传递方式的确立（二）、技术上三个重要成果（二）、技术上三个重要成果1.1.基因工程的工具酶基因工程的工具酶2.2.基因工程载体基因工程载体为了使为了使DNADNA片段能在宿主细胞中得以扩增

2、，须将其接到一个特片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特定能够进行自我复制的载体分子上。定能够进行自我复制的载体分子上。LederbergLederberg开始从事细菌开始从事细菌性因子（性因子（F F因子）研究。因子）研究。2020世纪世纪50-6050-60年代，相继发现其他质粒，年代，相继发现其他质粒，如抗药性基因（如抗药性基因（R R因子）和大肠杆菌因子（因子）和大肠杆菌因子（CoECoE）。这些工作为）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。基因工程载体系统的建立打下基础。3.3.基因的体外重组技术基因的体外重组技术19731973年，年，科恩（科恩（CohenCohen）

3、等人用等人用EcoR IEcoR I内切酶处理内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入将这种工程化的质粒转入大肠杆菌，在含有四环素大肠杆菌，在含有四环素和青霉素的平板中筛选重和青霉素的平板中筛选重组菌落。组菌落。同年，加利福尼亚的同年，加利福尼亚的博耶博耶（BoyerBoyer）也进行了类似也进行了类似的实验。的实验。重组子转化的成功标志着重组子转化的成功标志着基因工程的诞生基因工程的诞生。（三）、基因工程的研究内容（三）、基因工程的研究内容（一）、基因工程的相关概念

4、（一）、基因工程的相关概念3.3.目的基因目的基因 有时应用重组有时应用重组DNADNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNADNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物-蛋白质。蛋白质。4.4.基因载体基因载体 也称克隆载体。这是为也称克隆载体。这是为“携带携带”感兴趣的外源感兴趣的外源DNADNA、实现、实现外源外源DNADNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。其中，为使插入的外源分子。其中，为使插入的外源DNADNA序列可转录、进而翻序列可转录、进

5、而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的载体的DNADNA分子有质粒分子有质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA和病毒和病毒DNADNA。分子剪刀和分子针线分子剪刀和分子针线（二）、基因工程的工具酶（二）、基因工程的工具酶1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)(1)(1)定义定义是一类由细菌产生的能专一识别和是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称中的特定

6、碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam Bam HHu与甲基化酶共同构成细菌的与甲基化酶共同构成细菌的限制限制-修饰系统修饰系统：限：限制外源制外源DNADNA，保护自身，保护自身DNADNA，稳定细菌遗传性状。，稳定细菌遗传性状。u、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）EcoR 属属 种种 株株 序序Escherichia coli RY13株株大肠杆菌大肠杆菌 RY13株的第一种酶株的第一种酶 回文结构回文结构(palindrome)特异识别及切割特异识

7、别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片断，主要产生片断，主要产生3 3种末端结构：种末端结构：55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平端或钝端平端或钝端 回文序列回文序列(palindrome)(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O反向重复反向重复;粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的55末端突出和末端突出和33末端突出的碱基序列相互间具有互补性末端突出的碱基序列相互间具有互补性。Bam HGTCCAGG

8、CCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口 同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，后，产生相同的粘性末端，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A2.DNA2.DNA聚合酶聚合酶 （全酶）（全酶）*T*T*T*TMg2+D N a

9、 s e I53353 5533553355335dATP,dCTP,dGTP-32P dTTPE.coli DNA POL I3.TaqDNA3.TaqDNA聚合酶聚合酶(TaqDNA polymerase)4.4.逆转录酶逆转录酶5.5.DNA聚合酶聚合酶大片段大片段Klenow片段片段聚合酶Klenow DNA -32PdNTP双链DNA粘端5-外切酶变性+5335353533555533标记探针标记末端 用于用于cDNA克隆中克隆中第二股链的合成第二股链的合成；DNA序列分析。序列分析。6.DNA连接酶连接酶(DNA ligase)催化双链催化双链DNADNA中一条链的中一条链的3-O

10、H与另一条链的与另一条链的5-PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNADNA长链。长链。DNADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1）两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来5-ACG AATTCGT-3 5-ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-3 5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-53-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2）修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接连接酶酶7.碱性磷

11、酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）8.末端末端（脱氧核苷酸）转移酶（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)作用作用 将标记或未标记的将标记或未标记的dNTPdNTP加到加到DNADNA的的3 3-OH-OH末端；也可催化末端；也可催化载体分子或待克隆的载体分子或待克隆的DNADNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接3 3 3 3（三）、基因

12、工程的载体（三）、基因工程的载体来源分类来源分类：质粒载体：质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体人工染色体载体人工染色体载体用途分类用途分类：克隆载体：克隆载体表达载体表达载体 穿梭载体穿梭载体克隆载体克隆载体(cloning vector)能使插入的外源能使插入的外源DNA序列被复制、扩增序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为而不能表达，这样的载体为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)使插入的外源使插入的外源DNA序列转录翻译，表达序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为出多肽链，这样的载体称为表达载体表达载体。这类载体中含有来源不同的复制子结

13、构，既具这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备备原核细胞原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在片段在真核细胞真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择表达所需的结构元件和相应的选择标记基因标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达受体中进行复制和表达穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector)具有能使外源具有能使外源DNADNA片段组入的克隆位点。片段组入的克隆位点。能携带外源能携带外源DNADNA

14、进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体复制，或整合到染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的复制而复制。的复制而复制。必须具有选择标记，承载外源必须具有选择标记，承载外源DNADNA的载体进入受体细胞后，的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。以便筛选克隆子。分子量小，拷贝数高。分子量小，拷贝数高。具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。基因克隆载体必须具备三个条件基因克隆载体必须具备三个条件 松弛型的复制子、多克隆位点、松弛型的复制子、多克隆位点、筛选标记筛选标记.常见常见:质粒、噬菌体质粒、噬菌体克隆载体必需结构克隆载

15、体必需结构:具有具有复制子复制子，筛选标记筛选标记，位于多克隆位，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的点的上下游具有转录效率较高的启动子启动子，起始密码子和核糖体结合位点起始密码子和核糖体结合位点，转录终转录终止子止子结构结构表达载体结构特点：表达载体结构特点：基因工程生产胰岛素的原理（示意图）基因工程生产胰岛素的原理（示意图）几种主要的连接策略几种主要的连接策略二、接（体外重组）2、选择基因序列两侧固有酶切位点三、转（外源基因导入细胞）1、大肠杆菌的质粒转化（1）钙离子转化法（2）电穿孔法2、酵母的质粒转化方法（二）转化率（四）转化率的影响因素四、增（重组基因的扩增）五、检（检测转化子，

16、获得重组子）对于将外源DNA插入BamH和Sal之间位点IPTG可诱导可诱导LacZ基因片段编码基因片段编码-半乳糖苷酶氨基半乳糖苷酶氨基端片段端片段,与宿主细胞所编码的缺陷型与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实半乳糖苷酶实现基因内互补，又称现基因内互补，又称互补互补。当培养基中有。当培养基中有IPTG时，时，使含此质粒的菌在使含此质粒的菌在X-gal培养基上形成培养基上形成蓝色菌落蓝色菌落。lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解半乳糖半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lac

17、Z-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15蓝蓝-白白筛选：筛选：利用蓝色化合物的形成作为利用蓝色化合物的形成作为指示剂指示剂，筛选带重组质粒的细菌。，筛选带重组质粒的细菌。载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主：编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 -互补互补细菌表达：细菌表达：-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（X-gal）形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当

18、在质粒中当在质粒中插入外源插入外源DNADNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。（IPTG 存在下）存在下）互互补补的的检检测测显色筛选法实例3、限制酶切图谱检测4、PCR扩增检测根据插入DNA片段的序列设计并合成探针探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交