DNA体外合成与序列测定课件.ppt
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- DNA 体外 合成 序列 测定 课件
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1、DNA的体外合成的体外合成A.DNA的化学合成的化学合成u DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物,有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的,大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设 计制造的。2022-9-261南京农业大学 生命科学学院1.合成的原理合成的原理u核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上,然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。u每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作,由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上,所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。u合成至所
2、需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基,再经纯化即可得到最终产物。A.DNA的化学合成的化学合成1.合成的原理合成的原理2.核 酸 固相磷酰亚胺法合成时,末端核苷酸的3-OH与固相载体成共价键,5-OH被4,4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护,下一个核苷酸的5-OH亦被DMTr保护,3-OH上的磷 酸 基 上 有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团。2022-9-2632022-9-26南京农业大学 生命科学学院4每延伸一个核苷酸需四步化学反应:(1)脱三苯甲基:末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去,游离出5-OH。(2)缩合:新生成的5-OH 在四唑催化下与
3、下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3)盖帽:有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭,以防进一步缩合造成错误延伸。(4)氧化:新增核苷酸链中的磷为三价亚磷,需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次,核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。A.DNA的化学合成的化学合成2.合成后处理合成后处理u 合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上,且各种活泼基团也被保护基封闭着,要经过以下合成后处理才能最后应用。n切割切割:合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上,用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3-OH。n脱保护脱保护:切割后的寡核苷酸磷酸基及碱
4、基上仍有一些保护基,这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基-氰乙基在切割的同时即可脱掉,而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55放置15h左右方能脱掉。n纯化纯化:纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段,盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的,对要求不高的应用如PCR等可不纯化。n近年来发展了一些修饰试剂,可在合成寡核苷酸时,对某些核苷酸进近年来发展了一些修饰试剂,可在合成寡核苷酸时,对某些核苷酸进行一定的修饰,为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。行一定的修饰,为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。2
5、022-9-265第二节第二节 DNA的体外合成的体外合成B.聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)u 聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明,1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。u PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一,这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙,而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。u Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。2022-9-266南京农业大学 生命科学学院B.聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(
6、PCR)u PCR的原理:u 原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)底物和Mg2+存在的条件下,由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制,合成靶DNA。PCR包括三个基本过程:n变性变性。加热模板使其解离成单链。n退火退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。n延伸延伸。在适宜条件下,TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸,合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环,每一次循环的产物可作为下一次循环的模板,经过3035个循环后,界于两个引物之间的靶
7、序列得到大量复制,拷贝数约增加106107倍。2022-9-2672022-9-26南京农业大学 生命科学学院8核酸序列测定核酸序列测定uDNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后,反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。u在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。u目前应用最广泛的是:nSanger双脱氧链终止法。nMaxam-Gilbert DNA化学降解法。n新技术:杂交测序法,质谱法,单分子测序法,原子探针显微镜测序法,DNA 芯片法。2022-9-26南京农业大学 生命科学学院9Sanger双脱氧
8、链终止法双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识,只是当时在某些技术能力上和研年代末就已掌握了充分的理论知识,只是当时在某些技术能力上和研究思路上,存在着弱点,阻碍了从理论转变为现实。第一,究思路上,存在着弱点,阻碍了从理论转变为现实。第一,如何分离寡如何分离寡核苷酸片段核苷酸片段;另一方面,在;另一方面,在研究思路研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。缚。1965,Cornall大学以大学以SWHolle,为首的科学家小组,首次完成为首的科学家小组,首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种的全序列测定。即利
9、用各种RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸,经分离纯化后,再分别测定短片段顺序。降解成寡核苷酸,经分离纯化后,再分别测定短片段顺序。返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性:1、利用单链DNA模板,合成DNA互补链;2、利用2,3双脱氧核苷三磷酸作底物,参入到寡核酸链的末端,从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法,或酶催引物合成法。核酸序列测定核酸序列测定A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 基本原理基本原理:u 在模板指导下,DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端,使引物延长,合成
10、出新的互补的DNA链,如果加入双脱氧三磷酸核苷双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。u 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA,从而读取DNA核苷酸序列。2022-9-26南京农业大学 生命科学学院12q反应:反应:同时加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一种种ddNTP、以及以及 四种四种dNTP(有一种带放射性标记)。q变性胶电泳变性胶电泳分离反应混合
11、物。q放射自显影术放射自显影术,检测单链DNA片段的放射性带。q结果判读结果判读,从放射性X光 底 片 上,直 接 读 出DNA的核酸顺序。反应混合物中,标记什么最方便?反应混合物中,标记什么最方便?A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 基本原理基本原理:u 测序所用的测序所用的ddNTPu ddNTPs 是反应终止剂,可以当作正常碱基参与复制,一旦链入DNA中,其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1:34)。2022-9-26南京农业大学 生命科学学院14v 在自动测序中将荧光在自动测序中将荧光素连在素连在4种种ddNTP上上A.Sanger双脱
12、氧链终止法双脱氧链终止法u 基本步骤基本步骤:n测序模板的纯化与定量n测序反应PCR仪n测序反应产物纯化与变性n上样电泳测序仪n分析结果2022-9-26南京农业大学 生命科学学院152022-9-2616南京农业大学 生命科学学院2022-9-2617南京农业大学 生命科学学院毛细管电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 测序结果:2022-9-26南京农业大学 生命科学学院18uDNA测序仪的多种应用:测序仪的多种应用:2022-9-26南京农业大学 生命科学学院19Sanger双脱氧双脱氧-M13体系体系 DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成D
13、NA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分析分析:这样处理后,能:这样处理后,能策得高分子量策得高分子量DNA吗?吗?为了将这些降解的为了将这些降解的DNA片段,按其原来的顺序片段,按其原来的顺序“拼排拼排”起来,至少还需要用一种或数种其它内切限制酶,对起来,至少还需要用一种或数种其它内切限制酶,对同种同种DNA作酶切消化,并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化,并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗?实际上可行吗?高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段,然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段,然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝
14、胶作电泳分离纯化,从胶中抽取分离纯化,从胶中抽取DNA片段,供进一步分析。片段,供进一步分析。这些供作序列测定的这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅片段绝大多数都仅为数百个核酸为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。片段。费时费钱费时费钱,因,因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段,就需要制备足多数量的证能够获得所有的限制片段,就需要制备足多数量的DNA,而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这
15、种纯化过程中,会加剧在这种纯化过程中,会加剧DNA的损伤和丢失。的损伤和丢失。克服缺点的一种途径克服缺点的一种途径DNA分子克隆分子克隆将不同限制酶消化切割的将不同限制酶消化切割的DNA限制片段,随机地克隆到载限制片段,随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体,例如噬菌体,例如 M13作为作为载体,重组体噬菌体的载体,重组体噬菌体的DNA分子,可直接用作模板。分子,可直接用作模板。引物引物:合成的特定的寡核苷酸,或者是从亲本单链噬菌体合成的特定的寡核苷酸,或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同
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