植物组织培养技术1-3课件1.ppt

1、植物组织培养技术植物组织培养技术李兰芝生物安全科学技术学院A Glimpse of Plant Tissue Culture 主要内容：主要内容：概述概述植物组织培养含义植物组织培养含义组织培养的类型组织培养的类型植物组织培养的发展简史植物组织培养的发展简史植物组织培养在农业上的应用植物组织培养在农业上的应用本节教学目的与要求本节教学目的与要求(1)掌握组织培养的概念和类型；掌握组织培养的概念和类型；(2)掌握组织培养的特点；掌握组织培养的特点；(3)了解组织培养发展史；了解组织培养发展史；(4)初步掌握组织培养在农业实践初步掌握组织培养在农业实践上的应用。上的应用。一、什么是植物组织培养一、

2、什么是植物组织培养What Is Tissue Culture?Or in vitro culture?Or micropropagation?（一）概念：（一）概念：器官（器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子：根、茎、叶、花、果实、种子组织（组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等植物组织培养（植物组织培养（Tissue culture）是指用是指用无菌无菌方法使植物体的离体方法使植物体的离体（in vitro)in vitro)器官、组织和细胞在器官、组织和细胞在人为提供的条件人为提供的条件下生长和下生长和发育的所有培养技术的总称，也称

3、之为离体培发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（养（In vitro cultureIn vitro culture）或试管培养。）或试管培养。Characteristics of Plant Tissue Culture Techniques培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制v生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高植物组织培养特点植物组织培养特点v管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制（二）植物组织培养的理论基础（二）植物组织培养的理论基础细胞全能性细胞全能性1、细胞全能性、细胞全能性（cell totipotency)：植物体的每一个具有完整

4、细胞：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。发育成完整植物体的潜在能力。植物的脱分化和再分化能力使得细胞能产生整株植株，植物植物的脱分化和再分化能力使得细胞能产生整株植株，植物细胞的这种能力称为细胞全能性。细胞的这种能力称为细胞全能性。为什么？为什么？2、植物细胞全能性的表达、植物细胞全能性的表达 脱分化（脱分化（dedifferentiation)：将已分化的不分裂的静止细将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个胞，放在培养基上培养后，细胞

5、重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。和再分化。v 再分化（再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。植株的过程。细胞分化 愈伤组织中的细胞本质上是薄

6、壁组织细胞，在愈伤愈伤组织中的细胞本质上是薄壁组织细胞，在愈伤组织的再分化过程中，这些薄壁细胞能分化成各种组织的再分化过程中，这些薄壁细胞能分化成各种类型的细胞。细胞的这种转化称为细胞分化类型的细胞。细胞的这种转化称为细胞分化。器官分化 细胞最后分化成幼芽和胚胎，通过细胞最后分化成幼芽和胚胎，通过器官发生器官发生和和胚胎胚胎发生发生形成再生植株。形成再生植株。脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株3、植物组织培养过程、植物组织培养过程合适的外植体合适的外植体离体的植物器离体的植物器官、组织、细官、组织、细胞胞移栽移栽4、组织培养植株再生的途径、组织培养植株再生的途径魔

7、芋胚状体魔芋胚状体1）、体细胞胚胎发生途径）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）（胚状体发生途径）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚和子叶胚5 5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径。再生植株的途径。胚状体发生途径胚状体发生途径外植体外植体脱脱分分化化愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株再再分分化化2）、器官发生途径：）、器官发生途径：由愈伤组织或外

8、植体诱导形由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。生植株的方法。百合鳞叶培养百合鳞叶培养外植体器官发生途径外植体器官发生途径愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗胚状体胚状体小小麦麦愈伤组织器官发生途径愈伤组织器官发生途径外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)器官发生途径器官发生途径 外植体（外植体（explant)：由活体（由活体（in vivo)植物体上切取植物体上切取下来的，用于组织培养

9、的各种接种材料。包括下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。各种器官、组织、细胞或原生质体等。胡胡萝萝卜卜离离体体根根愈伤组织（愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。序生长状态的薄壁细胞。愈伤组织愈伤组织v按培养材料分为（按培养材料分为（Gamborg等等)：愈伤组织培养愈伤组织培养器器 官官 培培 养养细细 胞胞 培培 养养原生质体培养原生质体培养从外植体脱分化得到愈伤组织，最从外植体脱分化得到愈伤组织，最为常见的组织培养为常见的组织培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养单细胞培养单细胞培

10、养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养花和幼果的部分组织的培养（三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型种子培养种子培养 胚胎培养胚胎培养在液体培养基中培养单个细胞或小团细胞在液体培养基中培养单个细胞或小团细胞种子培养种子培养兰花种子作为外植体进行组织培养，兰花种子作为外植体进行组织培养，因为：因为：种子小，不含存储物质，播种时容易丢失，成活率低。种子小，不含存储物质，播种时容易丢失，成活率低。体外播种易使种子形成不成熟胚，从而缩短生育周期体外播种易使种子形成不成熟胚，从而缩短生育周期 种子生长环境适宜，避免菌类感染，萌发发育更

11、迅速。种子生长环境适宜，避免菌类感染，萌发发育更迅速。石斛兰的实生苗 胚胎培养胚胎培养 无菌状态下体外分离成熟或不成熟的胚，将胚进行再培养获无菌状态下体外分离成熟或不成熟的胚，将胚进行再培养获得再生植株。得再生植株。适宜培养不能形成种子的杂交种。适宜培养不能形成种子的杂交种。两种类型两种类型:成熟胚胎培养（子叶期以后）和未成熟胚培养成熟胚胎培养（子叶期以后）和未成熟胚培养（子叶期以前）（子叶期以前）操作过程：取材消毒操作过程：取材消毒-胚的剥离胚的剥离-接种接种-（看护）培养（看护）培养植物胚胎培养的意义植物胚胎培养的意义 1,克服杂种胚的败育,获得稀有杂种2,获得单倍体和多倍体植株3,打破种

12、子休眠,促进胚萌发4,快速繁殖良种,缩短育种周期5,克服种子生活力低下和自然不育性,提高种子发芽率6,提高后代抗性,改良品质7,种子活力的快速测定8,种质资源的搜集和保存9,研究胚胎发育的过程和控制机制愈伤组织培养愈伤组织培养 愈伤组织由薄壁细胞组成，但这些细胞并不是均一的一种一包，通常由分化细胞核未分化细胞两种类型细胞组成。影响因素：外植体材料 培养基：生长调节剂生长素、细胞分裂素 培养条件：温度、光等愈伤组织的诱导与培养愈伤组织的诱导与培养野生棉的愈伤组织地同母体组织连着。地同母体组织连着。三、愈伤组织分化与植株再生三、愈伤组织分化与植株再生试管苗移栽 根据培养器官的不同：根据培养器官的不

13、同：叶培养、根培养、花药培养、胚叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等珠培养、茎尖培养等烟烟草草（三）、植物组织培养的（三）、植物组织培养的类型类型l根据培养方式：根据培养方式：固体培养、液体培养固体培养、液体培养 固体培养固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。培养。液体培养液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。进行震荡，又称液体震荡培养。（三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型固体培养固体培养液体培养液体培养(1)固

14、体培养法固体培养法 是最常用的方法。该方法简单，易行，但是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。毒现象发生。(2)液体培养法液体培养法 由于液体中氧气含量较少，常用振动培养由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给的方法以确保氧气的供给 往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为一般为50-200r50-200rminmin，这种定期浸没的方法，既，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。能使培养基均一，又能保证氧气的供给。固体培养、

15、液体培养的特点：固体培养、液体培养的特点：l根据培养物量的多少：根据培养物量的多少：大量培养、微量培养大量培养、微量培养。l根据培养过程中是否需光：根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养光培养、暗培养l根据培养方法的不同：根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等平板培养、微室培养、悬浮培养等（三）、植物组织培养（三）、植物组织培养的类型的类型 按培养过程分为按培养过程分为:初代培养和继代培初代培养和继代培养养初代培养（初代培养（Primary culture）：）：指外植体的最初培养。指外植体的最初培养。继代培养（继代培养（Subculture）：）：将初代培养得到的培养体移植于新鲜

16、培养基中这将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。种反复多次移植的培养，称为继代培养。（三）、植物组织培养的（三）、植物组织培养的类型类型二、植物组织培养发二、植物组织培养发展简史展简史1 1、萌芽阶段萌芽阶段：(从从2020世纪初到世纪初到3030年代中）年代中）1838-1839 1838-1839年，德国科学家年，德国科学家Schleide Schleide 和和SchwannSchwann发表了细胞学发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。说，奠定了组织培养的理论基础。19021902年，德国植物学家年，德国植物学家Haberlandt Habe

17、rlandt 根据细胞学说，提出植物根据细胞学说，提出植物细胞全能性（细胞全能性（totipotencytotipotency）理论。）理论。19041904年，年，Hanning Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。19221922年，年，Knudson Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种克服其种子发芽困难的问题子发芽困难的问题1925年：年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种玉米成熟胚的培养玉米成熟胚的培养Haberlandt：观点：观点：贡献：贡献：提出细

18、胞全能性提出细胞全能性首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂无分裂细胞高度分化细胞高度分化+培养基中无生长激素培养基中无生长激素Knop+蔗糖蔗糖19341934年，美国植物生理学家年，美国植物生理学家White White 用番茄根尖建立起第一个活跃用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。2 2、奠基阶段奠基阶段（从（从202

19、0世纪世纪3030年代末年代末到到5050年代中）年代中）1934年：年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus1937年：年：White发现发现3种种B族维生素和族维生素和IAA对植物生长有用对植物生长有用1939年：年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功培养胡萝卜根小外植体成功1939年：年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1939年：年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功组织培养的奠基人组织培养的奠基人3、快速发展和应用阶段快速发展

20、和应用阶段（从（从20世纪世纪50年代末至今）年代末至今）l 1958 1958年，英国科学家年，英国科学家Steward Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株。这是株。这是第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一个突破。个突破。l 19601960年英国学者年英国学者CockingCocking用酶法分离原生质体成功。这是用酶法分离原生质体成功。这是植物组织培养的第二个突破。植物组织培养的第二个突破。l 196219

21、62年，年，Murashinge Murashinge 和和Skoog Skoog 在烟草培养中筛选出至今在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的仍被广泛使用的MSMS培养基培养基。l 1964-19661964-1966年，印度科学家年，印度科学家Guha Guha 和和Maheswari Maheswari 在曼陀罗花在曼陀罗花药培养中药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株首次由花粉诱导得到了单倍体植株。l19721972年，年，Carlson Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了获得了第一个体细胞杂交的杂种植株第一个体细胞杂交的杂种植株。

22、三、应用领域三、应用领域1、快速繁殖、快速繁殖2、种苗脱毒、种苗脱毒3、远缘杂交、远缘杂交8、植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产7、基因工程、基因工程 6、种质保存、种质保存4、突变育种、突变育种5、单倍体育种、单倍体育种四、植物组织培养在技术上的发展四、植物组织培养在技术上的发展q 研究材料范围逐步扩大研究材料范围逐步扩大q 培养方法逐步完善培养方法逐步完善q 培养基不断改进培养基不断改进q 实验手段逐步完备实验手段逐步完备植物再生植株的途径植物再生植株的途径小结：小结：(1)植物组织培养植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，

23、在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。完整植物体的过程。(2)类型：类型：按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。种类型。(3)组织培养特点组织培养特点：培养条件可以人为控制；生长周期短，：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速。而发展迅速。(4)组织培养技术在农业生产上的应用组织培养技术在农业生产上的应用主

24、要体现于以下几主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。工厂化育苗。植物组织培养实验室 构建及操作技术植物组织培养学植物组织培养学本节教学目的与要求：(1)掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。掌握调控组织培养的主要环境条件。(4)掌握灭菌和消毒的区别；掌握灭菌和消毒的区别；(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；p 商业性组织培养

25、实验室和小工厂的商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备设计与主要设备p 培养基及其配制培养基及其配制p 外植体的选择与培养外植体的选择与培养p 试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽 1 1、培养器皿的清洗；、培养器皿的清洗；2 2、培养基的配制、分装和高压灭菌；、培养基的配制、分装和高压灭菌；3 3、无菌操作、无菌操作材料的表面灭菌和接种；材料的表面灭菌和接种；4 4、将培养物放到培养室培养；、将培养物放到培养室培养；5 5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。、试管苗的驯化、移栽和初期管理。一 商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备一般组织培养的操作工序：一般组织培养的操作工序：一、

26、设计：一、设计：二、仪器设备和器皿用具1、超净工作台或接种箱、超净工作台或接种箱2、空调、空调3、除湿机或加湿器、除湿机或加湿器4、恒温培养箱、恒温培养箱5、高压灭菌锅、高压灭菌锅6、冰箱、冰箱7、天平、天平8、显微镜、显微镜9、水浴锅、水浴锅10、摇床与转床、摇床与转床11、蒸馏水发生器、蒸馏水发生器12、酸度计、酸度计13、离心机、离心机组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。组织培养实验室的组织培养实验室的

27、 设计与主要设备设计与主要设备1 1、镊子：尖头镊子、枪形、镊子：尖头镊子、枪形镊子镊子2 2、剪子、剪子3 3、解剖刀、解剖刀4 4、接种针、接种针5 5、钻孔器、钻孔器组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备二 培养基及其配制本节目的要求：本节目的要求：(1)(1)一般掌握培养基的种类、特点；一般掌握培养基的种类、特点；(2)(2)掌握基本培养基的配方；掌握基本培养基的配方；(3)(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)(5)熟练掌握

28、培养基的灭菌方法；熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)(6)一般掌握培养基的筛选办法。一般掌握培养基的筛选办法。一、培养基的成分培养基及其配制培养基及其配制培养基组成培养基组成1、无机营养元素(inorganic element)1)1)大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等。2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，CoCo等等。培养基及其配制培养基及其配制2、有机化合物(organic comp

29、ound)F最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。碳源。F 使用浓度在使用浓度在1%5%，常用，常用3%F 作用：碳源；维持培养基渗透压。作用：碳源；维持培养基渗透压。培养基及其配制培养基及其配制在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸烟酸)、Vc（抗坏血酸）、（抗坏血酸）、VH(生物素生物素)、VB11(叶酸叶酸)、VB12（钴胺素（钴胺素)等。等。使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.11.

30、0mgL。培养基及其配制培养基及其配制 又叫环己六醇，在糖类的相互转又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。化中起重要作用。使用浓度使用浓度：一般为：一般为lOOmglOOmgL L，作用作用：适当使用肌醇，能促进愈：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。也有作用。培养基及其配制培养基及其配制 作用作用：是很好的有机氮源，可直：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。接被细胞吸收利用。种类种类：最常用的是甘氨酸，其他：最常用的是甘

31、氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度使用浓度：为：为1010200mg200mgL L。培养基及其配制培养基及其配制3、有机附加物（天然复合物）培养基及其配制培养基及其配制椰乳椰乳香蕉香蕉马铃薯马铃薯酵母提取液酵母提取液4、植物生长调节物质(hormone)培养基及其配制培养基及其配制 *作用作用：主要被用于诱导愈伤组主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。进细胞伸长；促进生根。在促进生长方面，根对生长在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的

32、浓度下，素最敏感。在极低的浓度下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就可促进生就可促进生长，其次是茎和芽。长，其次是茎和芽。培养基及其配制培养基及其配制吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid)培养基及其配制培养基及其配制IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二

33、氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制种类：种类：6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Kt(kinetin 激动素激动素)Zt(zeatin 玉米素玉米素)培养基及其配制培养基及其配制Kt(激动素激动素)6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt(玉米素玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制GAGA3 3（赤霉酸）：（赤霉酸）：作用作用：促进幼芽伸长生长，促进：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。不定胚发育成小植株。赤霉素和生长素协同作用，赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当对形成层的分化有影响：当生生长素赤霉素比值

34、高长素赤霉素比值高时有利于时有利于木质部木质部分化，分化，比值低比值低时有利于时有利于韧皮部韧皮部分化。分化。培养基及其配制培养基及其配制5、培养材料的支持物-琼脂(agar)固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。用量：用量：6 610g10gL L。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至成为溶胶，冷却至40 40 即凝固为固体状凝胶。即凝固为固体状凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还

35、与关外，还与高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、pHpH值值等等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。凝固能力。培养基及其配制培养基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点缺点:培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触(即吸收即吸收)面积小，各面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢

36、，影响养分充分利用，种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。对组织产生毒害作用。固体培养固体培养液体培养液体培养培养基及其配制培养基及其配制6、抗生物质(antibiotic)种类：种类：青霉素、链霉素、庆大青霉素、链霉素、庆大霉素等。霉素等。浓度：浓度：520mg/L。作用：作用：可可防止菌类污染防止菌类污染。培养基及其配制培养基及其配制7、活性炭(active carbon)目的：目的：是是利用其吸附能力，减利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响少一些有毒物质的影响；利于；利于生根。生

37、根。使用浓度：使用浓度：15gL。它的颗粒大小决定着吸附能力：它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。减弱，甚至不吸附。培养基及其配制培养基及其配制作用：作用：是植物原生质体的组成成分，是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。规模生产时可用自来水。培养基及其配制培养基及其配制二、培养基的PH值(pH

38、value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节.3、注意：注意：p经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH会下降会下降0.2-0.8,0.2-0.8,固调整固调整pHpH值时值时,应高于应高于0.50.5；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，的大小会影响琼脂的凝固能力，当当pH6.0pH6.0时，培养基将会变硬，时，培养基将会变硬，pH 5.0pH 5.0时，琼脂凝固不好。时，琼脂凝固不好。培养基及其配制培养基及其配制种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4

39、.5胡萝卜、石刁胡萝卜、石刁柏柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7 培养基及其配制培养基及其配制不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表)培养基培养基(culture medium)：是植物组织培养的重是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在培养基能够适合一切类型的植物组织或器官

40、，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。的培养基，培养才有可能成功。三、培养基的种类、配方及特点培养基及其配制培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。改良培养基。培养基及其配制培养基及其配制

41、F 若只含有大量元素与微量元若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称素和碳水化合物的培养基，称为为基本培养基基本培养基。F 在基本培养基的基础上，添在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫其他有机附加物的培养基叫完完全培养基。全培养基。初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。培养基及其配制培养基及其配制母液名称母液名称 药品药品 名称名称 原配方量原配方量(mg)/L大量元素母大量元素母液液 NH4NO31650KNO31900CaCl2H2O440MgSO4 7H2

42、O370KH2PO4170微量元素母微量元素母液液 MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl6H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MO42H2O0.25KI0.83铁盐母液铁盐母液 FeSO47H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素 0.1培养基及其配制培养基及其配制1 1、MSMS培养基：培养基：它是它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养烟草细为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛胞而设计的。是目前

43、应用最广泛的培养基。的培养基。特点：特点：是无机盐离子浓度较高，是无机盐离子浓度较高，有高含量的有高含量的N N、K K，硝酸盐量大，硝酸盐量大，营养丰富。营养丰富。培养基及其配制培养基及其配制2 2、WhiteWhite培养基：培养基：19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。特点：特点：无机盐浓度较低，适于生无机盐浓度较低，适于生根培养。根培养。培养基及其配制培养基及其配制(4)B(4)B5 5培 养 基培 养 基:是是 1 9 6 81 9 6 8 年 由年 由GalmborgGalmborg等为培养大豆根细胞等为培养大豆根细胞而设计的。

44、而设计的。特点：特点：是含有较低的铵盐，较高是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。的硝酸盐和盐酸硫胺素。(5)KM(5)KM8P8P培养基培养基:它是它是19741974年为原生质体年为原生质体培养而设计的。培养而设计的。特点：特点：是有机成分较复杂，它包括了所有是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。的单糖和维生素。培养基及其配制培养基及其配制 四、培养基的配制（一）、母液（一）、母液(stock solution)的配的配制和保存制和保存 所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液。意义意义:保证各物质成分的准确保证各物质成分的准确性性 配制时的快速移取配制时的快速移

45、取 便于低温保藏。便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-10-100100倍。倍。母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素微量元素、铁盐、有机物和激素类等类等。培养基及其配制培养基及其配制单配法：单配法：将培养基配方中的各种成将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般分分别配成一定浓度的母液。一般用用mg/ml mg/ml 或或mg/Lmg/L表示。表示。混配法：混配法：将几类营养成分按配方中将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。解后再混合成母液

46、。配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒精助溶酒精助溶。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.5-1N盐酸加热溶解盐酸加热溶解。浓度为：。浓度为：1-1-5mg5mgmlml。培养基及其配制培养基及其配制 母液的配制方法：母液的配制方法：培养基母液的配制 母液名称母液名称 药品药品 名称名称 原配方量原配方量(mg)/L扩大倍数扩大倍数 称取量称取量 (mg)母液体积母液体积 (ml)移取量移取量 (ml)/L 大量元素母液大量元素母液 NH4N

47、O3165010165001000100KNO319001019000CaCl2H2O44010 4400MgSO4 7H2O370103700KH2PO417010 1700微量元素母液微量元素母液 MnSO4H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860CoCl6H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO42H2O0.25100 25KI0.83100 83铁盐母液铁盐母液 FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp

48、)0.5502550010盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.55025盐酸硫胺素盐酸硫胺素 0.1505肌醇肌醇 100505000培养基及其配制培养基及其配制（二）培养基的配制及其灭菌1.配制方法：配制方法：1 1、将母液按顺序摆放、将母液按顺序摆放2 2、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水(所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质4 4、加入蔗糖、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5、加琼脂、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5、定容、定容6 6、调

49、、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7 7、分装培养瓶，封口、分装培养瓶，封口8 8、高压灭菌、高压灭菌培养基及其配制培养基及其配制l组织培养常见的灭组织培养常见的灭菌方法菌方法消毒消毒:是指杀死、消除或充分抑是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生制部分微生物，使之不再发生危害作用。危害作用。灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。即把所有生命的物质全部杀死。培养基及其配制培养基及其配制常用的灭菌方常用的灭菌方法法物理方法物理方法化学方法化学方

50、法干热灭菌干热灭菌(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)湿热灭菌湿热灭菌(常压或高压蒸煮常压或高压蒸煮)射线处理射线处理(紫外线、超声波、微波紫外线、超声波、微波)过滤除菌过滤除菌大量无菌水冲洗大量无菌水冲洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福尔马林福尔马林)过氧化氢过氧化氢高锰酸钾高锰酸钾来苏儿来苏儿漂白粉漂白粉次氯酸钠次氯酸钠酒精酒精培养基及其配制培养基及其配制2.培养基的灭菌湿热灭菌法 培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭内完成灭菌工序。菌工序。高压灭菌的原理：高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，