PCR技术概述授课课件2.pptx
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- 关 键 词:
- PCR 技术 概述 授课 课件
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1、PCR技术 三篇重要论文 引物引物引物引物1983年 XX DNA聚合酶:大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,缺点:Klenow酶不耐高温,90会变性失活,每次循环都要重新加入。引物链延伸反应在37下进行,容易发生模板和引物之间的碱基错配,PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。
2、1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶特点:耐高温,在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。()
3、40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 知知识识点回点回顾顾复温 34)对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用各种生物标本(如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等)粗制的DNA扩增检测。PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万
4、倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。(5)碱基的随机分布 选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列,这样可以减少引物-引物同源互补的机会。也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡,两个引物的Tm值相差2-3范围内。引物浓度(3)循环参数变性的时间与温度 不同的DNA解链温度不同,由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大,解链温度越高。一般GC含量每增加1%,解链温度就增加0.4。典型的变性条件是95 30s或97 15s。过高使聚合酶失去活性,过低DNA变性不完全。变性温度在90-95 时,既能保证使DNA双链模板变性,又能保持Taq
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