分子生物学技术-分子生物学常用实验技术.ppt

1、分子生物学技术-分子生物学常用实验技术现代分子生物学现代分子生物学 遗传中心法则与组学遗传中心法则与组学 遗传信息传递的基本规律遗传信息传递的基本规律 分子生物学研究内容分子生物学研究内容生物大分子结构与功能生物大分子结构与功能生物大分子的相互作用生物大分子的相互作用 分子生物研究技术分子生物研究技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质、核酸分析技术蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用蛋白质蛋白质-核酸相互作用核酸相互作用工具酶的应用工具酶的应用遗传中心法则 基因信息的流向、基因表达的环节基因信息的流向、基因表达的环节与调控的不同水平；与调控的不同水平；DNA所占的中心位置；所占的中心位置；RNA

2、是信息表达的体现；是信息表达的体现；蛋白质执行生物学功能。蛋白质执行生物学功能。基因工程的基本原理基因工程的基本原理!生命的起源？生命的起源？基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系 基因组学是基础、基因组学是基础、转录组学是信息、转录组学是信息、蛋白质组学是功能、蛋白质组学是功能、代谢组学是结果。代谢组学是结果。整合也是创新整合也是创新 方法的结合方法的结合 形态与机能研究的结合形态与机能研究的结合 中西医的结合中西医的结合2121世纪分子医学发展的主要领域世纪分子医学发展的主要领域 分子诊断 基因治疗 生物工程药物第一讲第一讲蛋白质的分离、纯化、

3、鉴定蛋白质的分离、纯化、鉴定和结构分析和结构分析Isolation,Purification,Identificationand Structural Analysis of Proteins一一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀:是常用的蛋白质沉淀方法是常用的蛋白质沉淀方法 使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。盐析盐析(salt precipitat

4、ion)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。蛋白质沉淀。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特将某一纯化蛋白质免疫动物可获得

5、抗该蛋白的特异抗体。异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。抗原蛋白。免疫沉淀法免疫沉淀法（immunoprecipitation）二、二、透析及超滤法透析及超滤法:可清除蛋白质溶液中的小分子化合物可清除蛋白质溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。分开的方法。应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液

6、的目的。留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤法超滤法 透析透析(dialysis)(dialysis)三三、电泳、电泳:是蛋白质分离与鉴定的常用方法是蛋白质分离与鉴定的常用方法电泳电泳(elctrophoresis)蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为称为电泳电泳。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。等。SDS-聚丙

7、烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量，常用于蛋白质分子量的测定。的测定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。双向凝胶电泳双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。，蛋白质组学研究的重要技术。几种重要的蛋白质电泳：几种重要的蛋白质电泳：蛋白质的二维电泳蛋白质的二维电泳四四、应用相分配或亲和原理：、应用相分配或亲和原理：可将蛋白质进行层析分离可将蛋白质进行层析分离待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、（固定相

8、）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的白质的目的。层析层析(chromatography)(chromatography)离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。分离。

9、蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法五五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：、利用蛋白质颗粒沉降行为不同：可进行超速离心分离可进行超速离心分离超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。沉降系数沉降系数(sedimentation coefficient,S)蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场中的行为用沉降系数沉降系数表示表示,沉沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可大体上与分子

10、量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。六、用化学或反向遗传学方法：六、用化学或反向遗传学方法：可分析或演绎多肽链的氨基酸序列可分析或演绎多肽链的氨基酸序列分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨

11、基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。化学法化学法溶解法溶解法二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNP法）法）肼解法肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法氯法）还原成氨基醇法亮氨酸氨肽酶法亮氨酸氨肽酶法细胞外氨肽酶法细胞外氨肽酶法羧肽酶羧肽酶A A法法羧肽酶羧肽酶B B法法羧肽酶羧肽酶C C法法氨基酸和肽的末端测定法氨基酸和肽的末端测定

12、法通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列七、应用物理学、生物信息学原理：七、应用物理学、生物信息学原理：可进行蛋白质空间结构测定或预测可进行蛋白质空间结构测定或预测通常采用通常采用圆二色光谱圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的螺旋的CD峰有峰有222nm处的负峰、处的负峰、208nm处的负峰和处的负峰和

13、198nm处的正峰处的正峰3个个成分；而成分；而-折叠的折叠的CD谱不很固定。谱不很固定。（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)核磁共振技术核磁共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。（二）（二）X X射线衍射法和核磁共振技术：射线衍射法和核磁共振技术：用于三维空间结构分析用于三维空间结构分析1A2.Structure of dCTP 3.Base Tautomerism 3.Charg

14、aff rules-A=T,G=C helical10 layer Lines BetweenCrossPatterns(10 ResiduesPer turn)Evidence for the Double Helix1.Fiber Diffraction data:-Helical geometry-3.4 A spacing(1A=10-10 m)-34 A pitch*用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（三）根据氨基酸序列：（三）根据氨基酸序列：

15、预测预测蛋白质蛋白质三维空间结构三维空间结构*通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。白质空间结构的预测。30第二讲第二讲DNADNA操作的基本技术操作的基本技术The Basic Technologies for DNA Manipulations31 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization32什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸

16、分子杂交核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）以以DNADNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNADNA或或RNARNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成过复性处理后，形成异源双链异源双链的过程的过程 可用于基因诊断可用于基因诊断n核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子放单链分子放在同一溶液中，或把在同一

17、溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，只要在放在一起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。分子杂交与印迹技术的原理分子杂交与印迹技术的原理复性复性RNADNA印迹技术印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotti

18、ng”，译为印迹技术。译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探，探针可以与固定在针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。源的核酸分子存在。是基因诊断的常用技术是基因诊断的常用技术 探针技术探针技术基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威 1976年加州大学华裔科学家年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交技术首次对一例用核酸分子杂交技术首次对一例地中海贫地中海贫血进行诊断。血进行诊断。基因诊断的

19、概念、特点及临床意义基因诊断的概念、特点及临床意义 定义：定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是诊断检测的目标分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白质，也可以是蛋白质或者多肽或者多肽(分子诊断分子诊断）。）。诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNADNA、RNARNA或蛋白质水平变化。或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；录产物在体内从无到有、癌基因表达水

20、平从低到高；l基因结构变化基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转。如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。位引起基因异常激活或灭活。基因诊断的特点基因诊断的特点 高特异性高特异性 高灵敏性高灵敏性 早期诊断性早期诊断性 应用广泛性应用广泛性基因诊断中常用的分子生物学技术基因诊断中常用的分子生物学技术 核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridizationNucleic acid hybridization）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)单链构象多态性（单链构象多态性（SSCPSSCP）限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（

21、RFLPRFLP）DNADNA序列测定（序列测定（DNA sequencingDNA sequencing）生物芯片（生物芯片（biochipsbiochips）WesternWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blottingWestern blotting）免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较印迹技术印迹技术 44一、一、Southern Southern 印迹印迹:可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化 由由E.M.Southern在在1975年提出年提出 可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基

22、因拷贝数的变化 基本操作过程包括基本操作过程包括 待测待测DNA样品的样品的制备制备和基因探针的和基因探针的标记标记；待测待测DNA样品的样品的电泳电泳分离；分离；电泳分离的电泳分离的DNA经变性、经变性、转移转移、固定到合适的固相支、固定到合适的固相支持物；持物；特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段片段杂交杂交，放射自，放射自显影显影或或显色检测目的显色检测目的DNA的存在。的存在。Edwin Southern Sir Edwin Southern(born 1938),US biologist and deviser of the DNA analytical techniq

23、ue Southern blotting.This technique uses enzymes to fragment DNA(deoxyribonucleic acid),and the fragments are then separated in an electrophoresis gel.The separated fragments are then blotted onto a nitrocellulose filter and marked with radioactive probes.The probes indicate the presence of specific

24、 genes(lengths of DNA that code for proteins).A sheet of photographic film is then laid over the filter.The radioactivity darkens the film,which reveals the position of genes in the DNA.This technique is widely used in genetic research.Photographed in the 1980s.核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜

25、上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针47SouthernSouthern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液Northern Northern 印迹印迹 RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的的mRNA分子的含量与大小。分子的含量与大小。Northern印迹杂交印迹杂交(Nor

26、thern blotting)50二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR:可用于分析基因转录水平的变化可用于分析基因转录水平的变化 Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析定性分析mRNA的常用方法；的常用方法；RT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种定性或定量分析的一种方法；方法；二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化。三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较52

27、三、三、原位分子杂交技术原位分子杂交技术:可用于基因及其表达产物的定位分析可用于基因及其表达产物的定位分析 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。可用于基因及其表达产物的定位分析。53（一）（一）利用原位杂交技术利用原位杂交技术:进行基因定位分析进行基因定位分析 荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）基因组原位杂交基因组原位杂交（genom

28、e in situ hybridization，GISH）斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）将将RNA或或DNA变性后直接点样于硝酸纤变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。及其表达产物的定性及定量的研究。反向斑点杂交反向斑点杂交（reverse dot blotting）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品膜上，将样品RNA或或DNA标记变性后进行标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限

29、，大大提高了基因能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率诊断的效率。56FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）58（二）（二）利用原位杂交技术利用原位杂交技术:确定特定基因的表达定位确定特定基因的表达定位 RNA原位杂交原位杂交 整体原位杂交（整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization,WISH）固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization)待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的D

30、NA片段（片段（A、B片段），分别作为片段），分别作为捕捉探针捕捉探针（不标记的（不标记的A片段）和片段）和检测探检测探针针（标记的（标记的B片段），同时与靶基因杂交。片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及

31、表达是否异常达是否异常 间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。诊断的技术途径选择。（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知已知5/5/3/3/RFLP1.1.点突变的检测点突变的检测（1

32、 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 在在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.2.基因重

33、排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR PCR BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍珠蛋白生成障碍性贫血性贫血 根据引物根据引物3 3 端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR）3.3.基因表达异常的检测基因表达异常

34、的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测 DNA多态性：多态性：指群体中的指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，分子存在至少两种不同的类型，即个体间即个体间同一染色体同一染色体的的相同位置相同位置上核苷酸序列存在一上核苷酸序列存在一定的差异或变异。定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些

35、遗传性致病基因有一定连锁关系。传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标记遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)7.6kb13kb患患者者正正常常 HbSHbS的间接基因诊断的间接基因诊断 RFLPRFLP标记的连锁分析标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthe

36、rnSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针73聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction74什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K.MullisK.Mullis于于19831983年建立年建立；可用于分析基因

37、及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNADNA序列的相互作序列的相互作用。用。The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistryMulls Nobel Prize for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method B.194476PC

38、RPCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火772530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环2 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火 模板模板DNA 特异性引物

39、特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分 利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获得已知目为模板获得已知目的基因片段的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。文库或基因组文库中克隆基因。PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途

40、（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的量要求的量要求很低，是很低，是DNA和和RNA微量分析的最好方法。微量分析的最好方法。（二）（二）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（三）基因突变（三）基因突变 利用利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段

41、既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析PCRPCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用 RT-PCRRT-PCR 荧光定量荧光定量PCRPCR 多重多重-PCR-PCR PCR-ASOPCR-ASO AS-PCRAS-PCR PCR-SSCPPCR-SSCP PCR-RFLPPCR-RFLPRT-PCR85一、一、PCRPCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物 反转录反转

42、录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将）是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。进行定性及半定量分析的最有效方法。86mRNA 5 AAAAAA(n)3 mRNA 5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 oligo(dT)12-18反

43、转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n)5 AAAAAA(n)3 TTTTTT(n)5 反转录合成反转录合成cDNAcDNA 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR 寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大大提高检测结果的可靠性。大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位

44、基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO）PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNA 的突变造成的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单象多态性），利用迁移率的差别

45、可使各种序列不同的单链分离开来。链分离开来。PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 （restriction fragment length polymorphism,RFLP）由于由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。的片段。可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。进行检测。设计适当的扩增引物，使

46、扩增片段包括某一个设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限扩增后用该限制酶切割制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。即可作出诊断。PCR-RFLPABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoREcoR 限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化 1985年，英国遗传学家年，英国遗传学家Jeffeys等人用等人用TR的核心序的核心序列为探针进行列为探针进行RFLP分析分析时，检测到许多时，检测到许多HVR，并，并产生相应的图谱，

47、所得图产生相应的图谱，所得图谱具有高度的个体特异性，谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其的高度专一性，所以称其为为DNA指纹图谱（指纹图谱（DNA fingerprinting）。）。Alec John JeffreysOxford,United Kingdom 目目 录录Alec John Jeffreys亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。DNADNA指纹用于罪犯识别指纹用于罪犯识别99二、二、PCRPCR技术可

48、以进行实时、定量分析技术可以进行实时、定量分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355100三、三、PCRPCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNADNA序列序列PCRPCR与点突变与点突变 重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物由于采用具有互补末端的引物,使使PCR产物形成了重叠产物形成了重叠链链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来将不同来源的

49、扩增片段重叠拼接起来。源的扩增片段重叠拼接起来。重叠延伸重叠延伸PCRPCR技术技术 此技术利用此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸重叠延伸PCR技术成功的关键是技术成功的关键是重叠互补引物重叠互补引物的设计。的设计。重叠延伸重叠延伸PCR在基因的在基因的定点突变定点突变、融合基因融合基因的构建、的构建、长片段基因长片段基因的合成、的合成、基

50、因敲除基因敲除以及目的以及目的基因扩增基因扩增等方面有等方面有其广泛而独特的应用。其广泛而独特的应用。104 DNADNA序列测定序列测定DNA Sequencing105DNADNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变和发展 20世纪世纪70年代年代 双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F.Sanger 化学裂解法：化学裂解法：A.Maxam和和W.Gilbert 20世纪世纪80年代年代 PCR及自动测序技术及自动测序技术106一、一、DNADNA序列分析序列分析:有双脱氧链终止法和化学裂解法有双脱氧链终止法和化学裂解法（一）（一）SangerSanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法