第八章荧光分光光度法与检测技术课件.ppt

1、第八章第八章 荧光分析法检测技术及应用荧光分析法检测技术及应用 学习目的学习目的 知识要求知识要求 能力要求能力要求 学习目的学习目的知识要求知识要求能力要求能力要求u掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器的基本操作掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器的基本操作方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的操作技术。操作技术。第一节 荧光分光光度法的基本原理 u某些物质吸收紫外某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比可见光后，可以发射其波长比吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这种发射光称为荧光（种发射光

2、称为荧光（fluorescence）。）。u荧光分析法（荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧）是利用某些物质发射荧光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又称荧光光谱法称荧光光谱法第一节 基本原理一、荧光的产生过程一、荧光的产生过程（一）单重态与三重态（一）单重态与三重态A 单重基态单重基态 B 激发单重态激发单重态 C 激发三重态激发三重态第一节 基本原理（二）荧光的产生（二）荧光的产生 电子由激发单重态电子由激发单重态基态单重态的跃基态单重态的跃迁迁第一节 基本原理（二）磷光的产生（二）磷光的产生 电子由激发三重态电子由激发

3、三重态基态单重态的跃迁基态单重态的跃迁第一节 基本原理二、二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）第一节 基本原理 任何荧光物质都具有两个特征光谱：任何荧光物质都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱和荧光光谱（发射光谱）激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光波长而变化的关系曲线（以激发光波长波长而变化的关系曲线（以激发光波长ex为横坐标为横坐标，荧光的发光强度，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。为纵坐标的光谱）。第一节 基本原理荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让荧光光谱是当使激发光波长和强度不变

4、，而让物质物质所产生的荧光通过发射分光系统所产生的荧光通过发射分光系统(II)分光，测定每分光，测定每一发射波长荧光强度一发射波长荧光强度F，以发射光波长，以发射光波长em为横坐标为横坐标，荧光的发光强度，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。为纵坐标作图所得的关系曲线。第一节 基本原理 溶液荧光光谱具有如溶液荧光光谱具有如下特征：下特征：斯托克斯位移斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激荧光光谱的形状与激发波长无关发波长无关 荧光光谱与激发光谱荧光光谱与激发光谱的镜像关系的镜像关系蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）第一节 基本原理三、荧光与分子结构三、荧光与

5、分子结构 （一）荧光物质的特征（一）荧光物质的特征具有强的可见具有强的可见-紫外吸收，即具有紫外吸收，即具有K带强吸收带强吸收具有高的荧光效率具有高的荧光效率荧光效率荧光效率F发射荧光的量子数吸收激发光的量子数第一节 基本原理（二）分子结构与荧光的关系二）分子结构与荧光的关系大的共轭大的共轭键结构键结构第一节 基本原理分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性取代基的影响取代基的影响联苯联苯F=0.18芴芴F=1.0 第一节 基本原理（三）影响荧光强度的外界因素（三）影响荧光强度的外界因素温度温度溶剂溶剂溶液酸碱性溶液酸碱性荧光熄灭剂荧光熄灭剂散射光散射光激发光源激发光源第一节 基本原理 （四）

6、荧光分光光度计（四）荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和从各个角度反映了分子的成键和结构情况。结构情况。第一节 基本原理（一）仪器类型（一）仪器类型滤光片荧光计滤光片荧光计滤光片滤光片-单色器荧光计单色器荧光计荧光分光光度计荧光分光光度计第一节 基本原理（二）荧光分光光度计的基本结构（二

7、）荧光分光光度计的基本结构1.光源光源 2.4.7.9.狭缝狭缝3.激发单色器激发单色器 5.样品池样品池6.表面吸光物质表面吸光物质8.发射单色器发射单色器10.检测器检测器 11.放大器放大器 12.指示器指示器 13.记录器记录器第一节 基本原理光源光源 目前最常用的是氙灯目前最常用的是氙灯单色器（分光系统）单色器（分光系统）激发单色器激发单色器 发射单色器发射单色器样品池样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英检测器检测器 光电倍增管光电倍增管第一节 基本原理（三）仪器校准（三）仪器校准灵敏度校准灵敏度校准波长校准波长校准激发光谱和发射光

8、谱校准激发光谱和发射光谱校准请您比较荧光分光光度计与紫外请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光可见分光光度计的主要区别光度计的主要区别 第一节 基本原理点滴积累点滴积累荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。最强荧光波长最强荧光波长em和最强激发波长和最强激发波长ex是物质的定性是物质的定性依据，也是定量测定时的最适宜波长。依据，也是定量测定时的最适宜波长。强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构，如芳香环、稠环或杂环

9、；二、刚性和共平面性。如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。第一节 基本原理第二节 荧光定量分析第二节第二节 荧光定量分析荧光定量分析由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同，发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证证明明，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分光光度法对

10、荧光物质进行定量分析比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。的依据。第二节 荧光定量分析一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 当溶液中荧光物质的浓度为当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收，液层厚度为（吸收池内径）池内径）L时，由于荧光强度时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸正比于被荧光物质吸收光的强度：收光的强度：F（I0 I），用线性方程表示为），用线性方程表示为：F=K（I0 I）第二节 荧光定量分析 K为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：件下的荧光效率，结合比尔定律可得

11、到下式：F=2.303FI0cL 入射光强度入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定在波长一定，光源稳定时为固定值，因此可以将值，因此可以将2.303FI0L视为常数视为常数K，故：，故：F=Kc第二节 荧光定量分析 当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的依据。依据。但只有当荧光物质的浓度很小时，但只有当荧光物质的浓度很小时，即即cL 0.05，这种关系才成立。，这种关系才成立。课堂互动课堂互动请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏

12、度比紫外比紫外-可见分光光度法要高？可见分光光度法要高？第二节 荧光定量分析第二节 荧光定量分析二、定量分析方法二、定量分析方法标准曲线法标准曲线法 配制一系列浓度为配制一系列浓度为c1、c2、c3对照品溶液，对照品溶液，分别测其分别测其F1、F2、F3值，用值，用Fc作图绘制标准曲作图绘制标准曲线。线。然后在同样条件下测定试样溶液的然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准，在标准曲线上查找对应的浓度曲线上查找对应的浓度cx。第二节 荧光定量分析比例法比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围用比例法测定。即配制一对照品溶液（用比例法测定

13、。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强）测其荧光强度（度（Fs），再测定试样溶液（），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（）的荧光强度（Fx），），然后进行比较。测定时同样要以空白（然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：）校正：s0sx0 xFFcFFcx0 xss0FFccFF第二节 荧光定量分析多组分混合物测定多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同质不同的激发波长处的荧光强

14、度测定，也可选择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外-可见分光光度法广泛。可见分光光度法广泛。点滴积累点滴积累当其他条件（即当其他条件（即F、I0、L）一定时，荧光物质在）一定时，荧光物质在稀溶液中的荧光强度稀溶液中的荧光强度F与浓度与浓度c成正比。成正比。荧光分析的定量方法与紫外荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同可见分光光度法基本相同。第二节 荧光定量分析第三节应用与发展一、荧光分析的应用一、荧光分析的应用 （一）有机化合物的荧光分析（一）有机化合物的荧光分析芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系在芳香族及具有芳香结

15、构的化合物，因存在共轭体系在紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度和选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。面的应用很广。第三节应用与发展第三节应用与发展第三节应用与发展（二）无机化合物的荧光分析（二）无机化合物的荧光分析直接荧光法直接荧光法荧光猝灭法荧光猝灭法催化荧光法催化荧光法第三节应用与发展二、荧光分析新技术二、荧光分析新技术激光荧光分析激光荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析

16、同步荧光分析同步荧光分析胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析三维荧光光谱分析三维荧光光谱分析原油试样在环乙烷中的原油试样在环乙烷中的等角三维投影光谱图等角三维投影光谱图第八章 荧光分析法检测技术与应用一、选择题(一)单项选择题1.荧光光谱属于（）。A、吸收光谱 B、发射光谱 C、红外光谱 D、质谱2.分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（）。A、能发射荧光的物质比较少 B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱C、荧光波长比相应的吸收波长稍长D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰目标检测37第八章 荧光分析法检测技术与应用3.荧光量子效率是指（）。A、荧

17、光强度与吸收光强度之比 B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比4.一种物质能否发出荧光主要取决于（）。A、分子结构 B、激发光的波长 C、温度 D、溶剂的极性第八章 荧光分析法检测技术与应用5.下列叙述中，错误的是（）。A、荧光分析的待测物应含有大键 B、紫外分光光度法待测物应含有键C、质谱法待测物应含离子 D、气象色谱分析物的沸点应较低6.下列因素会导致荧光效率下降的有（）。A、激发光强度下降 B、溶剂极性变小 C、温度下降 D、溶剂中含有卤素离子39第八章 荧光分析法检测技术与应用7.荧光波长与相应激发光波

18、长相比（）。A、前者较长 B、后者较长 C、两者相等 D、关系不确定8.荧光光谱分析的主要优点是（）。A、准确度高 B、操作简便 C、仪器简单 D、灵敏度高9.荧光分光光度计与分光光度计的主要区别在于（）。A、光源 B、单色器 C、光路 D、检测器第八章 荧光分析法检测技术与应用（二）多项选择题1.下列关于分子荧光分析特点的叙述正确的是（）。A、检测灵敏度高 B、用量大，分析时间长 C、用量少，操作简便 D、选择性强 E、应用广泛2.分子中有利于提高荧光效率的结构特征是（）。A、双键数目较多 B、共轭双键数目较多 C、含重金属原子 D、分子为平面刚性 E、苯环上有给电子基团41第八章 荧光分析

19、法检测技术与应用3.下列跃迁方式属于无辐射跃迁的有（）。A、振动弛豫 B、内转换 C、体系间跨越 D、荧光发射 E、磷光发射4.分子荧光法与紫外-可见分光光法的主要区别为（）。A、分析方法不同 B、仪器结构不同 C、灵敏度不同 D、光谱带个数不同 E、光源不同第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为 ；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为 。2.荧光分光光度计的主要部件有 、四大部件组成。3.荧光分析法进行定量分析的依据是 。三、简答题1何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？2哪些因素会影响荧光波长和强

20、度？3请设计两种方法测定溶液Al3+的含量。（一种化学分析方法，一种仪器分析方法）43第八章 荧光分析法检测技术与应用二、填空题1.激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为 ；荧光波长固定后，荧光强度与激发光波长的关系曲线称为 。2.荧光分光光度计的主要部件有 、等四大部件组成。3.荧光分析法进行定量分析的依据是 。第八章 荧光分析法检测技术与应用四、实例分析题1用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取供试品20片（每片含炔雌醇应为31.538.5g），研细溶于无水乙醇中，稀释至250ml，滤过，取滤液5ml，稀释至10ml，在激发波长285nm和发射波长307nm处测定荧光强度。如炔雌醇对照品的乙醇溶液（1.4g/ml）在同样测定条件下荧光强度为65，则合格片的荧光读数应在什么范围内？45第八章 荧光分析法检测技术与应用2.用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2.00g食品，用10.0ml氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2.00ml，再用氯仿稀释为10.0ml。维生素B2氯仿标准溶液浓度为0.100g/ml。测得空白溶液、标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F0=1.5，Fs=69.5，Fx=61.5，求该食品中维生素B2的含量（g/g）。本章结束！谢谢！