高中生物人教版选修一血红蛋白的提取与分离课件.ppt
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1、一、课题目标一、课题目标 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法,并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后学习运用这些技术打下基础。二、课题重点与难点二、课题重点与难点课题重点:凝胶色谱法的原理和方法。课题难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么?分离生物大分子的基本思路是什么?选用一定的物理或化学的方法分离具选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。有不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么?蛋白质的分离和
2、提取的原理是什么?根据蛋白质各种特性的差异,如分根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。思考思考3 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA,用,用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行,便于进行DNA的提取,哺乳的提取,哺乳动物的红细胞无细胞核,结构简单,动物的红细胞无细胞核,结
3、构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。白。一、基础知识:一、基础知识:凝胶色谱法(凝胶色谱法(分配色谱法分配色谱法)1、凝胶、凝胶 一些微小多孔的球体(内含许多贯穿一些微小多孔的球体(内含许多贯穿的通道,由的通道,由多糖类化合物多糖类化合物构成构成,如葡聚糖、如葡聚糖、琼脂糖,具多孔的凝胶就叫分子筛)。琼脂糖,具多孔的凝胶就叫分子筛)。2、凝胶色谱法的概念、凝胶色谱法的概念 根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的的大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来进行蛋白质分离。作用,来进行蛋白质分离。3、
4、原理:、原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,相当不同的蛋白质通过凝胶时,相对(对()的蛋白质容易进)的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程(入凝胶内部的通道,路程(),移动),移动速度(速度();而);而()的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在(在()移动,路程()移动,路程(),),移动速度(移动速度(),相对分子质量不同),相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快 1、概念:在一定的范围内,能对抗外、概念:在一定的
5、范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用缓冲作用,具,具有缓冲作用的溶液叫做有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液缓冲溶液。缓冲溶液:缓冲溶液:2、作用:、作用:能够抵制(能够抵制()的对溶液)的对溶液的(的()的影响,维持)的影响,维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由(通常由()种缓冲剂溶解于水)种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的(中配制而成。调节缓冲剂的()就可以制得(就可以制得()使用的)使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用
6、比例在不同在不同PH范围内范围内思考:思考:说出人体血液中的缓冲对。说出人体血液中的缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3电泳电泳1、概念:指带电粒子在、概念:指带电粒子在电场的作用电场的作用下发生下发生 迁移迁移的过程。的过程。思考:思考:在血红蛋白整个实验室中用的缓在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么?它的目的是什么?冲液是什么?它的目的是什么?使用的是使用的是磷酸缓冲液磷酸缓冲液,目的是利用缓,目的是利用缓冲液模拟细胞内的冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)白的正常结构和功能,便于观察(红色)和材料的科学研
7、究(活性)。和材料的科学研究(活性)。2、原理:许多重要的生物大分子,如、原理:许多重要的生物大分子,如()等都具有)等都具有()在在()下,这些基团会带上下,这些基团会带上()。在电场的作用下,这些。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其(带电分子会向着与其()电极移动。电泳利用了待分离样品中各种电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子(分子()以及分子本身)以及分子本身的(的()、()、()的不同使带电分)的不同使带电分子产生不同的(子产生不同的(),从而实现),从而实现样品中各种分子的分离。样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反
8、的所带电荷相反的带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH聚丙烯酰胺凝胶:聚丙烯酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺在引发剂双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和催化过硫酸铵)和催化剂(四甲基已二胺)的作用下剂(四甲基已二胺)的作用下聚合交联成聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。的具有三维网状结构的凝胶。3、分类、分类琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定(测定()时,)时,通常用十二烷基硫酸钠通常用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。蛋白质相
9、对分子质量蛋白质相对分子质量 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()()。SDSSDS能使蛋白质发生能使蛋白质发生完全变完全变性性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDSSDS的作的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是()()。SDSSDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质-SDS-SDS复合物,复合物,SDSSDS所带负电荷的量大所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差
10、别,使电泳迁移率完全不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于取决于()()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带它所带的多少以及的多少以及等因素。等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小 聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率,但核酸比蛋白质分具有较高的分辨率,但核酸比蛋白质分子子大得多大得多,只能采用较大孔径的琼脂糖,只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根,酸根,核酸带负电荷核酸带负电荷,在电场中向正极,在电场中向正极
11、移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下,发出橙红色荧光。根紫外线的照射下,发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置,可以据荧光条带的粗细和分布的位置,可以用在对用在对PCR扩增效果的鉴定上。扩增效果的鉴定上。说说 明明二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步:蛋白质的提取和分离一般分为四步:1.样品处理样品处理水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血血液液血浆血浆血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞(最多)(最多)血红血红蛋白蛋白()两个两个-肽链肽链两个两个-肽链肽链样品处理样品
12、处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定90 目的目的:去除(:去除(),以利于后续),以利于后续步骤的分离纯化。步骤的分离纯化。方法方法:()离心(速度越离心(速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果),然后用胶头同沉淀达不到分离的效果),然后用胶头吸管吸出上层透明的(吸管吸出上层透明的(),将下),将下 每条肽链环绕(每条肽链环绕(),此),此基团可携带(基团可携带()。血红)。血红蛋白因含有(蛋白因含有()而呈红色。)而呈红色。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子一分子氧或一分子COCO2 2血红素血红素(1)红
13、细胞的洗涤红细胞的洗涤杂蛋白杂蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆1.样品处理样品处理层(层()的红细胞液体倒入烧杯,)的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的(再加入五倍体积的()(质)(质量分数为量分数为0.90.9的氯化钠溶液的氯化钠溶液),缓慢),缓慢搅拌搅拌10min10min,低速短时间离心,如此,低速短时间离心,如此重重复洗涤(复洗涤()次,直至上清液中没)次,直至上清液中没有(有(),表明红细胞已洗涤干净。),表明红细胞已洗涤干净。生理盐水生理盐水三三黄色黄色暗红色暗红色(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加(加()到()到()体)体积,再加积,再加40体积的(体积的()()
14、(溶解细溶解细胞膜胞膜),置于(,置于()上充分搅)上充分搅拌拌10分钟(加速细胞破裂)分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释细胞破裂释放出血红蛋白。放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好混合分离血红蛋白溶液:将搅拌好混合液转移到离心管内,以液转移到离心管内,以2000r/min的的速度离心速度离心10 min,试管中的溶液分为,试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第第1层(最上层):层(最上层):()甲苯层)甲苯层第第2层(中上层):层(中上层):()的沉淀层,的沉淀层,()色薄层固体)色薄层固体第第3层(中下层):层(中下层):()的水溶液层的水溶
15、液层 ()的液体)的液体 第第4层(最下层):层(最下层):其它杂质(其它杂质()的沉淀层)的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色 用滤纸用滤纸过过滤滤,除去脂溶,除去脂溶性沉淀层,于性沉淀层,于分液漏斗中静分液漏斗中静置片刻后,置片刻后,分分出下层的红色出下层的红色透明液体。透明液体。有机溶剂有机溶剂脂类物质脂类物质血红蛋白溶液血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 取取1mL的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入()中,将透析袋放入盛有)中,将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的的()中,)中,
16、pH为(为(),),透析透析12小时。目的是小时。目的是()或)或用于更换样品中的(用于更换样品中的()。)。透析袋一般用透析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素(玻璃(玻璃纸)制成。纸)制成。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作1)凝胶色谱柱的制作)凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米,内径厘米,内径1.61.6厘米的玻璃管,两厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。柱底部的制作:柱底部的制作:打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网,再用,再用1
17、00100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞,、选择合适的的橡皮塞,中间打孔;中间打孔;b b、在橡皮塞上部切出锅底状的、在橡皮塞上部切出锅底状的(),在),在0.5mL0.5mL的(的()头部切)头部切下(下()长的一段,插入橡皮塞孔内,)长的一段,插入橡皮塞孔内,上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cmc.c.剪尼龙网小圆片覆盖在剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的橡皮塞的凹面凹面上,用上,用100目目的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞上部上部包好,插到玻璃管一端。包好,插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端
18、用移液头部做出口部出口部位位,连接一细的,连接一细的尼龙管尼龙管,并用螺旋,并用螺旋夹控制尼龙管的夹控制尼龙管的打开与关闭打开与关闭,另一,另一端放入收集端放入收集色谱流出液色谱流出液的收集器内。的收集器内。安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作:顶塞的制作:插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装:将上述三者按相应位置组装成一组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体个整体。2)凝胶色谱柱填料的处理)凝胶色谱柱填料的处理(1 1)凝胶的选择:)凝胶的选择:()()(G-75G-75)“G G”表示凝胶的表示凝胶的交联程度交联程度,膨胀程度,膨胀程度 及分离范围。及分离范围。
19、7575表示凝胶的表示凝胶的得水值得水值,即每克凝胶,即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。(2 2)方法:)方法:配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于(的凝胶浸泡于()中充分溶胀后,)中充分溶胀后,配成(配成()。)。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶固定:将色谱柱垂直固定在支架上。固定:将色谱柱垂直固定在支架上。装填:装填:将将()一次性的缓慢一次性的缓慢倒入(倒入()内,装填时轻轻敲动色)内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。谱柱,使凝胶填装均匀。(3)凝胶色谱柱的装填方法)凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液
20、凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意:注意:凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在:泡存在:因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。的洗脱次序,降低分离效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗?的装填要紧密、均匀吗?凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能
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