临床微生物学检验技术-第14章-需氧革兰阳性杆菌3-课件.ppt

1、u棒状杆菌属棒状杆菌属u炭疽芽孢杆菌属炭疽芽孢杆菌属u蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌u产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌u红斑丹毒死菌红斑丹毒死菌u阴道加特纳菌阴道加特纳菌第一节第一节 棒状杆菌属棒状杆菌属u棒状杆菌属棒状杆菌属(CorynebacteriumCorynebacterium)的细的细菌：革兰阳性，菌体菌：革兰阳性，菌体一端或两端膨大一端或两端膨大呈棒状呈棒状的杆菌的杆菌u与分枝杆菌属和诺卡菌属一样，是细与分枝杆菌属和诺卡菌属一样，是细胞壁含短链分枝菌酸的菌属，属放线胞壁含短链分枝菌酸的菌属，属放线菌目，棒状杆菌科。菌目，棒状杆菌科。u引起人类疾病主要为引起人类疾病主要为白喉棒状杆菌

2、白喉棒状杆菌 一、临床意义一、临床意义u白喉棒状杆菌（白喉棒状杆菌（C.diphtheriae）简称白喉杆菌，）简称白喉杆菌，是白喉的病原菌是白喉的病原菌u白喉白喉急性呼吸道传染病，患者咽喉部可出现急性呼吸道传染病，患者咽喉部可出现灰白色假膜灰白色假膜，故名白喉，故名白喉u国家法定报告管理国家法定报告管理乙类传染病乙类传染病u存在患者及带菌者的鼻腔、咽喉部及器官黏膜。存在患者及带菌者的鼻腔、咽喉部及器官黏膜。参考Centers for Disease Control and PreventionEpidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable

3、 Diseases,13th Edition曾是儿童发病和死亡的主要疾病之一曾是儿童发病和死亡的主要疾病之一现全球发病率低，我国现全球发病率低，我国1314年无病年无病例报道例报道1.1.所致疾病所致疾病白喉白喉传染源：传染源：患者及带菌者患者及带菌者(鼻咽腔粘膜鼻咽腔粘膜)传播途径传播途径：随飞沫或污染的物品传播随飞沫或污染的物品传播易感人群：易感人群：人群普遍易感，人群普遍易感，24岁儿童发病率最高岁儿童发病率最高临床表现临床表现：本菌不侵入血流：本菌不侵入血流,但但外毒素外毒素吸收入血造吸收入血造成毒血症成毒血症。u局部炎症:假膜u全身中毒症状：如心肌炎、软腭麻痹、声嘶、肾上腺功能障碍等

4、症状 一、临床意义一、临床意义参考Centers for Disease Control and PreventionEpidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases,13th Edition白喉假膜白喉假膜82.2.致病物质致病物质白喉毒素白喉毒素u产生：产生：携带携带-噬菌体噬菌体白喉棒状杆菌带有编码外毒素的白喉棒状杆菌带有编码外毒素的tox基基因，噬菌体侵入白喉棒状杆菌，在溶原阶段因，噬菌体侵入白喉棒状杆菌，在溶原阶段tox基因即可基因即可整合到宿主染色体上，使之产生毒素。整合到宿主染色体上，使之产生毒素。u影响影响t

5、ox+基因的表达因素：基因的表达因素：(即白喉毒素的产生即白喉毒素的产生)与菌体内与菌体内无机铁含量无机铁含量密切相关。铁含量适量密切相关。铁含量适量(0.14g/ml),tox+基因基因表达；铁含量高表达；铁含量高,tox+基因不表达。基因不表达。3.3.免疫性免疫性抗毒素中和作用抗毒素中和作用u终身免疫终身免疫u体液免疫为主体液免疫为主 一、临床意义一、临床意义 二、生物学特性二、生物学特性1.1.形态染色形态染色菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状。细菌常菌体细长微弯，一端或两端膨大呈棒状。细菌常排列呈排列呈V V、L L等或栅栏状等或栅栏状具具异染颗粒异染颗粒，主要成分是核糖核酸和多磷酸

6、盐，在鉴定时主要成分是核糖核酸和多磷酸盐，在鉴定时有重要意义。有重要意义。v革兰染色阳性，异染颗粒着色深,可使菌体呈明显节段性。v美蓝染色：菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒。vNeisser或Albert等法染色，异染颗粒与菌体颜色不同1112AlbertAlbert染色：染色：菌体菌体绿色绿色，异染颗粒呈，异染颗粒呈蓝蓝黑色黑色；NeisserNeisser（柰瑟染色）：（柰瑟染色）：菌体菌体黄褐色黄褐色，异，异染颗粒呈染颗粒呈棕褐色棕褐色；菌体排列不规则；菌体排列不规则13 二、生物学特性二、生物学特性14 2.2.培养特性培养特性需氧或兼性厌氧菌。需氧或兼性厌氧菌。在吕氏血清斜面（含凝固

7、血清的）在吕氏血清斜面（含凝固血清的）：生长迅速，细小灰：生长迅速，细小灰白菌落，涂片染色异染颗粒明显。白菌落，涂片染色异染颗粒明显。血平板：长出血平板：长出1-2 mm1-2 mm、不透明的、不透明的S S型菌落。轻型有狭窄的型菌落。轻型有狭窄的溶血环溶血环亚碲酸钾的血平板：亚碲酸钾的血平板：常用的鉴别选择培养基含常用的鉴别选择培养基含0.030.03-0.040.04亚碲酸钾，亚碲酸钾能抑制杂菌，且白喉杆菌能亚碲酸钾，亚碲酸钾能抑制杂菌，且白喉杆菌能吸收亚碲酸钾使其还原为元素碲，吸收亚碲酸钾使其还原为元素碲，菌落呈黑色菌落呈黑色。15 二、生物学特性二、生物学特性163.3.分型分型u根据

8、细菌在亚碲酸钾的血平板生长情况分三型根据细菌在亚碲酸钾的血平板生长情况分三型 重型（重型（Var.gravis）:为不溶血、大、灰白、不规则、有条为不溶血、大、灰白、不规则、有条纹。纹。轻型（轻型（Var.mitis）:为狭窄为狭窄溶血、小、黑色、光泽、凸起。溶血、小、黑色、光泽、凸起。中间型（中间型（Var.intermedium）:不溶血的小菌落，外形在重不溶血的小菌落，外形在重型和轻型之间。型和轻型之间。u在液体培养基生长情况在液体培养基生长情况重型有菌膜重型有菌膜轻型分散生长轻型分散生长中间型沉淀生长。中间型沉淀生长。17 二、生物学特性二、生物学特性18194.抵抗力抵抗力 对湿热抵

9、抗力不强，煮沸对湿热抵抗力不强，煮沸1min死亡。死亡。对寒冷、干燥和日光抵抗力强。在衣服、床单、对寒冷、干燥和日光抵抗力强。在衣服、床单、玩具上可存活数天至数周。玩具上可存活数天至数周。5%石炭酸中石炭酸中min、3%来苏尔中来苏尔中10min死亡。死亡。对青霉素、氯霉素、红霉素敏感对青霉素、氯霉素、红霉素敏感。20 二、生物学特性二、生物学特性三、微生物学检验三、微生物学检验1.1.标本采集标本采集 从假膜边缘采集分泌物，立即送检或从假膜边缘采集分泌物，立即送检或浸于无菌生理盐水或浸于无菌生理盐水或15%15%甘油盐水中保存。甘油盐水中保存。2.2.直接涂片镜检直接涂片镜检 标本革兰和异染

10、颗粒染色镜检。标本革兰和异染颗粒染色镜检。如发现如发现G+G+棒状杆菌，且有异染颗粒，棒状杆菌，且有异染颗粒，可作可作“直接直接涂片检出形似白喉棒状杆菌涂片检出形似白喉棒状杆菌”的初步报告，为临的初步报告，为临床早期诊断提供依据。床早期诊断提供依据。3.3.分离培养分离培养 u亚碲酸钾血琼脂平板：亚碲酸钾血琼脂平板：将标本接种将标本接种,37,37培养培养181824h24h后后,呈现呈现1mm1mm、黑色或灰黑色特点的典型菌落。、黑色或灰黑色特点的典型菌落。u吕氏血清斜面：吕氏血清斜面：生长迅速，细小灰白菌落，涂片染生长迅速，细小灰白菌落，涂片染色异染颗粒色异染颗粒22三、微生物学检验三、微

11、生物学检验4 4毒力试验毒力试验 鉴定致病产毒菌株的重要依据鉴定致病产毒菌株的重要依据(1)琼脂平板毒力试验（琼脂平板毒力试验（Elek平板）：平板）：u将含有将含有20（马）血清（马）血清Elek琼脂注于平皿中琼脂注于平皿中u将浸有将浸有500-l000 uml抗白喉毒素的滤纸条沉于琼脂内，抗白喉毒素的滤纸条沉于琼脂内，37孵育孵育45-60 minu在与滤纸条垂直方向将待检菌划线接种，同时接种标准产毒在与滤纸条垂直方向将待检菌划线接种，同时接种标准产毒株作为阳性对照，株作为阳性对照，37培养培养 24-48h。u若菌苔两侧出现斜向外侧延伸的乳白色沉淀线，并与其邻近若菌苔两侧出现斜向外侧延伸

12、的乳白色沉淀线，并与其邻近的标准产毒株的沉淀线相吻合，则为产毒株。的标准产毒株的沉淀线相吻合，则为产毒株。23三、微生物学检验三、微生物学检验(2)SPA协同凝集试验协同凝集试验25三、微生物学检验三、微生物学检验(3)(3)对流免疫电泳对流免疫电泳(4)(4)动物试验动物试验采用家兔或豚鼠皮内试验法。采用家兔或豚鼠皮内试验法。5.免疫力检测免疫力检测 锡克试验（锡克试验（Schick test）：调查人群对白喉棒状杆菌是否）：调查人群对白喉棒状杆菌是否有免疫力的皮肤试验有免疫力的皮肤试验 毒素与抗毒素中和试验毒素与抗毒素中和试验 用于流行病学调查及疫苗免疫效果观察用于流行病学调查及疫苗免疫效

13、果观察 目前，临床上使用较少。目前，临床上使用较少。三、微生物学检验三、微生物学检验毒力试验毒力试验直接涂片直接涂片染色镜检染色镜检（G 染色染色及异染颗及异染颗粒染色）粒染色）患者或带菌者咽喉、鼻咽拭子等患者或带菌者咽喉、鼻咽拭子等吕氏血清斜面吕氏血清斜面351218h亚碲酸钾亚碲酸钾BAP、352448hBAP3516-18h涂片染色涂片染色镜检镜检(G(G染染色和异染色和异染颗粒染色颗粒染色）观察菌落观察菌落特点特点吕氏血清斜面吕氏血清斜面生化反应生化反应涂片染色镜检涂片染色镜检检验程序检验程序第二节第二节 炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌（B.anthracis）一、概述一、概述u俗称俗称炭疽

14、杆菌炭疽杆菌。是动物和人类。是动物和人类炭疽病炭疽病的病原菌。的病原菌。u人类历史上第一个被发现的病原菌，人类历史上第一个被发现的病原菌，1849年德国年德国Pollender首先发现首先发现,由由Koch于于1877年分离获得。年分离获得。u为为人畜共患病原菌人畜共患病原菌，食草动物（牛、羊等）最易感，食草动物（牛、羊等）最易感，是二类动物疫病、法定报告的是二类动物疫病、法定报告的乙类乙类传染病。传染病。u炭疽病死亡率高、传染性强，具有芽胞，抵抗力强。炭疽病死亡率高、传染性强，具有芽胞，抵抗力强。u曾被恐怖分子用作生物武器制造曾被恐怖分子用作生物武器制造“生物恐怖生物恐怖”。美国的炭疽邮包事

15、件美国的炭疽邮包事件2001年年二、临床意义二、临床意义1、炭疽病人畜共患病原菌n传染源传染源：患病食草动物及其制品或被污染物。：患病食草动物及其制品或被污染物。n传播途径传播途径:可通过多种途径传播（可通过多种途径传播（呼吸道、消化道和接触传播呼吸道、消化道和接触传播）,主要由于接触病畜或污染的皮毛制品而感染，主要由于接触病畜或污染的皮毛制品而感染，发病者发病者以以农牧民和皮毛加工者多见；农牧民和皮毛加工者多见；n具有明显的具有明显的职业性职业性和和地区性地区性。二、临床意义二、临床意义 2、致病物质荚膜：抗吞噬，有利于细菌在宿主组织中大量荚膜：抗吞噬，有利于细菌在宿主组织中大量生长繁殖；生

16、长繁殖；炭疽毒素炭疽毒素：是感染者致病和死亡的主要原因。：是感染者致病和死亡的主要原因。保护性抗原（保护性抗原（PAPA）、致死因子（）、致死因子（LFLF）、水肿因子）、水肿因子（EFEF）组成的外毒素复合物。）组成的外毒素复合物。二者均由质粒编码二者均由质粒编码 PAPA：结合单位：结合单位 LFLF和和EFEF：效应单位，单独存在无生物活性：效应单位，单独存在无生物活性 PA+LFPA+LF：致死毒素：致死毒素 PA+EFPA+EF：水肿毒素：水肿毒素二、临床意义二、临床意义3、所致疾病炭疽皮肤炭疽皮肤炭疽肠炭疽肠炭疽肺炭疽肺炭疽均可并发败血症，甚至炭疽性脑膜炎，死亡率极高均可并发败血症

17、，甚至炭疽性脑膜炎，死亡率极高（2.96%12.97%）。）。二、临床意义二、临床意义皮肤炭疽：皮肤炭疽：最多见，占最多见，占98%，危险性小，应用抗，危险性小，应用抗生素可降低死亡率。生素可降低死亡率。感染方式感染方式：破损皮肤或黏膜进入皮下破损皮肤或黏膜进入皮下 吞噬细胞吞噬细胞吞噬细菌，生长繁殖吞噬细菌，生长繁殖 皮肤、黏膜坏死、无痛性皮肤、黏膜坏死、无痛性溃疡、黑色焦痂溃疡、黑色焦痂等。等。症状症状：小丘疹：小丘疹顶部水泡（内含淡黄色液体及大量病顶部水泡（内含淡黄色液体及大量病原菌）原菌）周围水肿周围水肿血性黑癍血性黑癍血性溶合，形成焦痂）血性溶合，形成焦痂）肠炭疽肠炭疽：食用污染的肉

18、制品引起，以全身有持食用污染的肉制品引起，以全身有持续续腹泄、呕吐、水样便腹泄、呕吐、水样便等，中毒症状为主，病死等，中毒症状为主，病死率为率为25%25%60%60%。肺炭疽肺炭疽：呼吸道吸入芽胞所致。有低热、胸疼、呼吸道吸入芽胞所致。有低热、胸疼、咳嗽等症状，后发展成咳嗽等症状，后发展成血痰、呼吸困难血痰、呼吸困难等中毒症等中毒症状，病情严重，状，病情严重，病死率高达病死率高达89%89%。4、免疫性u感染后可获得持久性免疫力。感染后可获得持久性免疫力。三、微生物学特性三、微生物学特性 1、形态与染色u最大的最大的G粗大杆菌，粗大杆菌，510m1mu新鲜标本单个或短链排列新鲜标本单个或短链

19、排列u人工培养人工培养两端平切两端平切，竹节状排列竹节状排列（本（本菌形态的典型特征），菌体之间有明菌形态的典型特征），菌体之间有明显的间隙显的间隙u无鞭毛无鞭毛u在机体内可形成在机体内可形成荚膜荚膜，外环境中形成，外环境中形成芽胞芽胞（位于菌体中央，小于菌体（位于菌体中央，小于菌体）u荚膜的形成：荚膜的形成：有毒菌株有毒菌株在人和动物体在人和动物体内能形成荚膜；内能形成荚膜；在含在含血清和碳酸氢钠血清和碳酸氢钠的的培养基中，孵育于培养基中，孵育于COCO2 2环环境下，也能形成荚膜境下，也能形成荚膜,是是炭疽杆菌的特征炭疽杆菌的特征。荚膜具有较强的抗腐败荚膜具有较强的抗腐败能力，当菌体因腐败

20、而消能力，当菌体因腐败而消失后，仍有残留荚膜，称失后，仍有残留荚膜，称为为“菌影菌影”。u有芽胞：有芽胞：在在下易形成芽胞。下易形成芽胞。在活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。在活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度。2、培养特性u 需氧或兼性厌氧，营养要求不高；需氧或兼性厌氧，营养要求不高；u 普通琼脂平板普通琼脂平板无毒株形成无毒株形成灰白色、扁平、干灰白色、扁平、干燥、粗糙型菌落燥、粗糙型菌落,在低倍镜下菌落边缘呈在低倍镜下菌落边缘呈卷发状卷发状。u 血平板血平板不溶血或轻微溶血菌落；

21、不溶血或轻微溶血菌落；u 肉汤肉汤形成长链，呈形成长链，呈絮状沉淀絮状沉淀生长；生长；u 含含NaHCONaHCO3 3的血平板的血平板有毒株为有毒株为黏液型黏液型菌落（有菌落（有荚膜），无毒株为粗糙型菌落。荚膜），无毒株为粗糙型菌落。卷发样菌落卷发样菌落3、生化反应u能分解多种糖类，葡萄糖（能分解多种糖类，葡萄糖（+），乳糖（），乳糖（-）u吲哚、硫化氢阴性，吲哚、硫化氢阴性，u能凝固牛乳，能凝固牛乳，u卵磷脂酶弱阳性，卵磷脂酶弱阳性，u触酶阳性。触酶阳性。u液化明胶：呈漏斗状液化明胶：呈漏斗状u细菌性抗原细菌性抗原4、抗原构造u炭疽毒素炭疽毒素菌体多糖抗原菌体多糖抗原荚膜多糖抗原荚膜多糖抗

22、原芽孢抗原芽孢抗原4、抗原构造 细菌性抗原细菌性抗原n菌体多糖抗原：菌体多糖抗原：为多糖抗原，耐热、耐腐、与毒为多糖抗原，耐热、耐腐、与毒力无关力无关 病畜腐败脏器或皮毛煮沸后取滤液与炭疽特异性抗病畜腐败脏器或皮毛煮沸后取滤液与炭疽特异性抗体发生沉淀反应（体发生沉淀反应（Ascoli 热沉淀反应热沉淀反应）。对炭疽有）。对炭疽有一定的诊断价值，但特异性不高，存在交叉反应。一定的诊断价值，但特异性不高，存在交叉反应。适用于皮革检疫；或已腐败的尸体脏器标本的血清适用于皮革检疫；或已腐败的尸体脏器标本的血清学检验学检验n荚膜多糖抗原：荚膜多糖抗原：仅见于有毒菌株仅见于有毒菌株，与毒力有关。体内有抗吞

23、噬作用，与毒力有关。体内有抗吞噬作用,称为称为侵袭因子，有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染。侵袭因子，有助于病菌在体内繁殖扩散和建立感染。高效价抗荚膜多糖抗体作高效价抗荚膜多糖抗体作荚膜肿胀试验荚膜肿胀试验，有一定诊断意义。，有一定诊断意义。n芽胞抗原芽胞抗原：芽胞外膜、中层及皮质层共同组成，具：芽胞外膜、中层及皮质层共同组成，具有血清学诊断价值。有血清学诊断价值。炭疽毒素炭疽毒素 由保护性抗原（由保护性抗原（PAPA）、致死因子（）、致死因子（LFLF）和）和水肿因子（水肿因子（EFEF）组成。）组成。PAPA抗吞噬，介导抗吞噬，介导LF LF 和和EFEF进入细胞及免疫原性进入细胞及免疫原

24、性LFLF致死成分，导致细胞凋亡致死成分，导致细胞凋亡EFEF可增加血管通透性，造成组织水肿，感染性休可增加血管通透性，造成组织水肿，感染性休克，克，DICDIC等等以上三成分必须紧密结合才会发挥毒性作用以上三成分必须紧密结合才会发挥毒性作用5.抵抗力u本菌繁殖体的抵抗力不强，本菌繁殖体的抵抗力不强，6060 3060min即可杀即可杀死。在未解剖的尸体中，细菌可随腐败而迅速死亡。死。在未解剖的尸体中，细菌可随腐败而迅速死亡。u本菌本菌芽胞的抵抗力很强芽胞的抵抗力很强，在干燥土壤或皮毛中常温，在干燥土壤或皮毛中常温下可存活数下可存活数十年十年（2030年年）,传染性可持续数十传染性可持续数十年

25、之久。年之久。u芽胞对碘及氧化剂较敏感芽胞对碘及氧化剂较敏感,1,1：25002500碘液、碘液、0.50.5过过氧乙酸氧乙酸10min10min即杀死。即杀死。u对青霉素等多种抗生素高度敏感，可用于临床治疗对青霉素等多种抗生素高度敏感，可用于临床治疗。四、微生物检验四、微生物检验（一）标本采集与处理（一）标本采集与处理u病理性标本病理性标本皮肤炭疽皮肤炭疽病灶深处分泌物病灶深处分泌物肺炭疽肺炭疽痰或血液痰或血液肠炭疽肠炭疽粪便或呕吐物等粪便或呕吐物等直接接种增菌液直接接种增菌液平板划线分离平板划线分离属二类，大量活菌操属二类，大量活菌操作需在作需在BSL-3实验室实验室进行，做好个人防护进行

26、，做好个人防护（一）标本采集与处理（一）标本采集与处理u可疑污染物可疑污染物（如皮革、兽毛、谷物等）浸泡，振（如皮革、兽毛、谷物等）浸泡，振荡，取上层悬液置荡，取上层悬液置65水浴水浴30min 或或85 5 min（杀死非芽胞菌，保留芽胞活性）再进行增菌和（杀死非芽胞菌，保留芽胞活性）再进行增菌和分离培养。分离培养。疑似炭疽动物的尸体严禁室外解剖，以防芽胞形疑似炭疽动物的尸体严禁室外解剖，以防芽胞形成及扩散。成及扩散。（二）标本直接检查（二）标本直接检查1 1、直接显微镜检查、直接显微镜检查 病理标本涂片、印片，干燥，固定（用病理标本涂片、印片，干燥，固定（用1 1：10001000升汞固定

27、升汞固定以杀死芽胞）以杀死芽胞）G G染色染色典型形态（典型形态（G G+粗大杆菌，两端平切、竹节状排列，有荚膜）粗大杆菌，两端平切、竹节状排列，有荚膜）初步报告初步报告2 2、荚膜荧光抗体染色、荚膜荧光抗体染色 链状大粗杆菌周围有发荧光的荚膜者为阳性链状大粗杆菌周围有发荧光的荚膜者为阳性，在临床上，在临床上有诊断意义。有诊断意义。3 3、核酸检测：、核酸检测：测测pXO1pXO1质粒编码的质粒编码的PAPA片段片段荚膜荧光抗体染色荚膜荧光抗体染色（三）分离培养与鉴定（三）分离培养与鉴定 1 1、分离培养、分离培养 一般接种一般接种血琼脂平板血琼脂平板，3535、18-24h18-24h后可观

28、察到后可观察到较大、较大、灰白色、边缘不整齐和有轻微溶血灰白色、边缘不整齐和有轻微溶血的菌落。的菌落。2 2、鉴定、鉴定 (1)(1)形态学特征形态学特征：镜检形态（菌体）和菌落形态。镜检形态（菌体）和菌落形态。(2)(2)生化试验：见表生化试验：见表14-3 18714-3 187生化试验生化试验炭疽芽炭疽芽胞杆菌胞杆菌枯草芽胞枯草芽胞杆菌杆菌蜡样芽胞蜡样芽胞杆菌杆菌苏云金芽苏云金芽胞杆菌胞杆菌蕈状芽胞蕈状芽胞杆菌杆菌巨大芽胞巨大芽胞杆菌杆菌荚膜荚膜+动力动力+厌氧生长厌氧生长+硝酸盐还原硝酸盐还原+VV-P+卵磷脂酶卵磷脂酶+甘露醇甘露醇+溶血溶血+青霉素抑制青霉素抑制+噬菌体裂解噬菌体裂

29、解+串珠试验串珠试验+u 取用取用37 37 、4-6h4-6h待检肉汤培养物，涂布于待检肉汤培养物，涂布于普通琼脂平板普通琼脂平板u将将AP631AP631炭疽噬菌体炭疽噬菌体1 1滴，于平板中央划一直滴，于平板中央划一直线线,置置3718h3718h，出现噬菌斑或噬菌带者为阳，出现噬菌斑或噬菌带者为阳性，性，u每份标本应作每份标本应作2-32-3个同样的试验，同时滴种肉个同样的试验，同时滴种肉汤液作阴性对照。汤液作阴性对照。(3)噬菌体裂解试验Lysis of Bacillus anthracis by the lytic phage gamma.u将待检菌接种于含青霉素将待检菌接种于含青

30、霉素0.050.050.5U/ml0.5U/ml的培养的培养基基,经经3737培养培养 6 h6 h后，炭疽杆菌可发生形态后，炭疽杆菌可发生形态变化变化u显微镜下见大而显微镜下见大而均匀的圆球状菌体均匀的圆球状菌体呈成串样列呈成串样列为阳性为阳性u类炭疽杆菌无此现象。类炭疽杆菌无此现象。(4)串珠试验u将待检菌分别接种于青霉素将待检菌分别接种于青霉素5 5、1010、100U100Uml ml 的的普通琼脂平板，普通琼脂平板，37 37 培养培养24h24hu炭疽芽胞杆菌一般在含炭疽芽胞杆菌一般在含5 U5 Umlml的青霉素平板上的青霉素平板上仍能生长仍能生长u在含在含1010、100U10

31、0Umlml青霉素的平板上受到抑制而不青霉素的平板上受到抑制而不生长生长 (5)青霉素抑制试验u 将待检菌新鲜肉汤培养物将待检菌新鲜肉汤培养物0.1ml滴于预温的兔血滴于预温的兔血清琼脂平板上，用清琼脂平板上，用L形玻棒均匀涂布，干后用含形玻棒均匀涂布，干后用含青霉素青霉素1 U片纸片贴于平板，片纸片贴于平板，37 12h，u 低倍镜下观察，可见纸片周围有一无菌生长的低倍镜下观察，可见纸片周围有一无菌生长的抑菌环抑菌环，其外周青霉素浓度低，其外周青霉素浓度低,菌体细胞壁受抑菌体细胞壁受抑而成为串珠。平板继续而成为串珠。平板继续37孵育孵育812h,测量抑测量抑菌环直径。菌环直径。(6)串珠青霉

32、素抑制联合试验(7)荚膜肿胀试验u取洁净的玻片一张，两侧各加待检菌，一侧加取洁净的玻片一张，两侧各加待检菌，一侧加高效价的荚膜多肽血清，另一侧加正常兔血清，高效价的荚膜多肽血清，另一侧加正常兔血清，混匀，再加混匀，再加1%1%亚甲蓝染色，镜检。若试验侧，亚甲蓝染色，镜检。若试验侧，蓝色细菌周围厚薄不等，边界清晰无色环状物，蓝色细菌周围厚薄不等，边界清晰无色环状物，对照无此现象，则为阳性。不产生无色环状物对照无此现象，则为阳性。不产生无色环状物为阴性试验。为阴性试验。（8）重碳酸盐生长毒力试验u将待检菌接种于含将待检菌接种于含O.5O.5NaHCONaHCO3 3和和1010马血清马血清的琼脂平

33、板上的琼脂平板上u置置1010COCO2 2环境环境3724-48h3724-48hu有毒株有毒株形成形成荚膜荚膜，菌落呈，菌落呈粘液型粘液型，无毒株不，无毒株不形成荚膜，呈粗糙型菌落。形成荚膜，呈粗糙型菌落。u取纯培养物接种于肉汤培养液取纯培养物接种于肉汤培养液3724h,3724h,吸取吸取0.1m10.1m1接种小鼠皮下接种小鼠皮下,u小鼠于小鼠于727296h96h发病并死亡发病并死亡 接种部位接种部位呈胶样水呈胶样水肿，肝脾肿大出血，血液黑色且不凝固肿，肝脾肿大出血，血液黑色且不凝固：u取心血、肝脾涂片染色镜检分离培养，可检出取心血、肝脾涂片染色镜检分离培养，可检出炭疽杆菌。炭疽杆菌

34、。(9)毒素动物试验检验程序检验程序Ascoli试验试验动力动力确定确定报告报告痰液、呕吐物及炎性分泌物痰液、呕吐物及炎性分泌物直接涂片直接涂片革兰染色革兰染色 荚膜染色荚膜染色动物毒力动物毒力试验试验初步报告初步报告皮毛、腐败脏皮毛、腐败脏器等标本器等标本以生理盐水制成悬液以生理盐水制成悬液经加温处理经加温处理血液血液肉汤増菌肉汤増菌BAP革兰染色革兰染色菌落观察菌落观察生化生化反应反应串珠串珠试验试验噬菌噬菌体裂体裂解解青霉青霉素抑素抑制制毒力毒力试验试验2%兔血兔血清肉汤清肉汤快速増快速増菌菌第二节第二节 蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌u属于需氧芽胞杆菌属中的一种革兰阳性杆菌，因在属于需氧芽胞

35、杆菌属中的一种革兰阳性杆菌，因在普通营养琼脂平板上能形成普通营养琼脂平板上能形成芽胞芽胞，其菌落表面粗糙，其菌落表面粗糙似似白蜡状白蜡状，故名，简称蜡样杆菌。，故名，简称蜡样杆菌。u广泛分布于水、土壤、尘埃、淀粉制品、乳及乳制广泛分布于水、土壤、尘埃、淀粉制品、乳及乳制品等食品，并可在其中生长繁殖，引起品等食品，并可在其中生长繁殖，引起食物中毒食物中毒。u与受污染的米饭或淀粉制品有关。与受污染的米饭或淀粉制品有关。食物中毒：含菌量达食物中毒：含菌量达10105 5个个/g/g以上，以夏秋季最为以上，以夏秋季最为多见。多见。腹泻型：腹泻型：由不耐热肠毒素引起，进食后发生胃肠炎症状，由不耐热肠毒素

36、引起，进食后发生胃肠炎症状，主要为腹痛、腹泻和里急后重，偶有呕吐和发热。主要为腹痛、腹泻和里急后重，偶有呕吐和发热。进食后进食后615h发病，病程发病，病程24h 呕吐型：呕吐型：由耐热的肠毒素引起，于进餐由耐热的肠毒素引起，于进餐0.50.56h6h发病发病,主要主要是恶心、呕吐，仅有少数有腹泻。类似于葡萄球菌的食物是恶心、呕吐，仅有少数有腹泻。类似于葡萄球菌的食物中毒，病程平均中毒，病程平均 10h10h。二、所致疾病二、所致疾病中毒食物大多为中毒食物大多为剩米饭和熟肉类剩米饭和熟肉类食品，此外还有奶制食品，此外还有奶制品、鱼类食品、糕点食品、以及各种肉菜汤等。品、鱼类食品、糕点食品、以及

37、各种肉菜汤等。中毒食物大多中毒食物大多无腐败变质无腐败变质,表现为完全正常的感官性表现为完全正常的感官性状状。肉及制品的带菌率为肉及制品的带菌率为10-2610-26，乳及制品带菌率，乳及制品带菌率为为23-7723-77 。u全眼球炎全眼球炎(外伤后外伤后)、心内膜炎、败血症和脑膜炎、心内膜炎、败血症和脑膜炎等。等。二、所致疾病二、所致疾病三、微生物特性三、微生物特性 1.1.形态染色形态染色uG+G+大杆菌，两端钝圆，多数呈大杆菌，两端钝圆，多数呈短链状排列。短链状排列。u形成椭圆形芽胞，位于菌体中形成椭圆形芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。心或次极端，不小于菌体。u引起食物中毒的菌

38、株多为周毛引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜。菌，有动力，不形成荚膜。2.2.培养特性培养特性u为需氧或兼性厌氧，营养要求不高。为需氧或兼性厌氧，营养要求不高。u在普通平板上在普通平板上3535生长良好。菌落较大，表面生长良好。菌落较大，表面 粗糙似粗糙似白蜡状白蜡状。u在肉汤生长迅速，在肉汤生长迅速，6h6h后形成后形成菌膜菌膜。u在血平板呈草绿色或在血平板呈草绿色或溶血。溶血。u在卵磷脂平板上因分解卵磷脂产生在卵磷脂平板上因分解卵磷脂产生乳白色浑浊环乳白色浑浊环l在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂平板上，在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂平板上，菌落粉红色菌落粉红色、周围有粉红色的晕周围有粉红色

39、的晕3.3.生化反应生化反应u能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素、果糖等。能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素、果糖等。能胨化牛乳能胨化牛乳,液化明胶，液化明胶，VPVP试验阳性。试验阳性。u 乳 光 反 应乳 光 反 应：在 含 卵 磷 脂 平 板 上 因 分 解 卵：在 含 卵 磷 脂 平 板 上 因 分 解 卵 磷脂产生甘油脂和磷脂胆碱，在菌落周围出现乳磷脂产生甘油脂和磷脂胆碱，在菌落周围出现乳白色浑浊环。白色浑浊环。4.4.抵抗力强抵抗力强，芽胞能耐受，芽胞能耐受100 30min100 30min。1.1.标本采集标本采集 采取可疑食物、粪便和呕吐物进行检验，必须作采取可疑食物、粪便和

40、呕吐物进行检验，必须作活菌计数。暴露空气中的食品都受本菌污染。活菌计数。暴露空气中的食品都受本菌污染。三、微生物检验三、微生物检验u取待测标本取待测标本25g（ml）（按照）（按照GB4789.2-2010测定）用灭菌生测定）用灭菌生理盐水制成理盐水制成10-110-5 的稀释液取的稀释液取0.1ml注入空的无菌平皿，注入空的无菌平皿，将溶化冷至将溶化冷至45甘露醇卵黄多黏菌素琼脂适量倾入并立即混甘露醇卵黄多黏菌素琼脂适量倾入并立即混匀匀u冷凝后置冷凝后置35培养培养24-48h，计数产生粉红色且周围有粉红色，计数产生粉红色且周围有粉红色晕的菌落乘以稀释倍数，即为每毫升样品所含活菌数晕的菌落乘

41、以稀释倍数，即为每毫升样品所含活菌数u认为超过认为超过105CFUg或或ml时，时，即有发生食物中毒的可能即有发生食物中毒的可能 2 2活菌计数活菌计数涂布法或倾注平板法涂布法或倾注平板法3.3.分离培养分离培养 u普通琼脂平板：菌落大、粗糙、有蜡光；普通琼脂平板：菌落大、粗糙、有蜡光；u血平板：血平板：溶血溶血u液体培养基：均匀浑浊、有菌膜、散在沉淀；液体培养基：均匀浑浊、有菌膜、散在沉淀；u卵黄琼脂平板：菌落周围有乳白色浑浊环卵黄琼脂平板：菌落周围有乳白色浑浊环（有有 卵磷脂酶，分解卵磷脂生成甘油酯和水溶性磷卵磷脂酶，分解卵磷脂生成甘油酯和水溶性磷 脂胆碱所致）。脂胆碱所致）。根据形态结构

42、、活菌计数、分离培养、生化反应等根据形态结构、活菌计数、分离培养、生化反应等特点可作出初步鉴定特点可作出初步鉴定确诊由该菌引起的食物中毒必须确诊由该菌引起的食物中毒必须：u从食物中分离出菌数从食物中分离出菌数105CFU/g，提示本菌活跃生长，提示本菌活跃生长，构成潜在危险构成潜在危险u从可疑食物分离到的菌株与从病人粪便和从可疑食物分离到的菌株与从病人粪便和(或或)呕吐物呕吐物中分离到的菌株属同一血清型中分离到的菌株属同一血清型检验程序检验程序呕吐物、残留食物等呕吐物、残留食物等活菌计数活菌计数 接种接种 普通琼脂平板、普通琼脂平板、BAP、卵黄平板、卵黄平板3718-24h纯培养纯培养动物试

43、验（肠动物试验（肠毒素测定）毒素测定）生化反应生化反应血清凝集（分型）血清凝集（分型）报告结果报告结果直接涂片染色镜检直接涂片染色镜检小结小结u白喉棒状杆菌引起白喉，主要与白喉毒素有关，革兰白喉棒状杆菌引起白喉，主要与白喉毒素有关，革兰染色阳性，一端或两端膨大呈棒状、菌体有异染颗粒，染色阳性，一端或两端膨大呈棒状、菌体有异染颗粒，具有诊断价值；常用吕氏血清斜面及亚碲酸钾血琼脂具有诊断价值；常用吕氏血清斜面及亚碲酸钾血琼脂平板培养；检测到白喉棒状杆菌，需做毒力试验确定平板培养；检测到白喉棒状杆菌，需做毒力试验确定是否为产毒株是否为产毒株u炭疽芽孢杆菌，引起人和动物的炭疽病。主要致病炭疽芽孢杆菌，引起人和动物的炭疽病。主要致病物质荚膜和炭疽毒素。革兰阳性大杆菌，两端平切，物质荚膜和炭疽毒素。革兰阳性大杆菌，两端平切，培养后竹节状排列，有芽孢椭圆形，位于菌体中央。培养后竹节状排列，有芽孢椭圆形，位于菌体中央。无毒株形成粗糙型卷发样菌落，液体培养基中絮状无毒株形成粗糙型卷发样菌落，液体培养基中絮状沉淀，沉淀，小结小结