临床免疫学检验-课件-第13章-流式细胞分析技术1.pptx

1、第十三章 流式细胞分析技术 概概 述述流式细胞术流式细胞术（flow cytometryflow cytometry，FCMFCM）：）：是基于流式细胞仪流式细胞仪的一项快速、精确、高通量针对微粒微粒（细胞）（细胞）的特征或功能进行多参数定性、定量分析和分选的新型技术。流式细胞术的流式细胞术的特点：特点：快速、高通量、准确、灵敏、定性或定量地对完整细胞群体分析反映出细胞群体的生物学特征或功能，或根据微粒（细胞）的特征进行分选，进而研究其生物学特征和功能。第一节第一节 流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理一、概一、概 述述流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometerflow

2、 cytometer）：）：是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分析仪器。流式细胞仪特点：流式细胞仪特点：速度快，每秒可测量数万个微粒；精度高；准确性好；多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特性的多参数测量。二、经典流式细胞仪二、经典流式细胞仪（一）基本结构一）基本结构 经典分析型的流式细胞仪的结构组成液流系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 信号检测：光源、光束形成器（流动室前光学系统）、流动室后光学系统 转换及放大

3、系统：光电转换器、放大器和信号处理电路 计算机分析系统分选型流式细胞仪分选系统：荧光激活细胞分选系统（FACS）经典流式细胞仪的结构经典流式细胞仪的结构（二）分析工作原理（二）分析工作原理荧光染色待测单细胞悬液 进样器系统 液流 细胞流 驱动系统 流动室 鞘 液 单细胞流 检测区域 激光 激发细胞 荧光素 PMT/PD检测器 信号放大 FSC/SSC 计算机 信号转换、储存和分析。液流系统和液流聚焦示意图液流系统和液流聚焦示意图喷嘴喷嘴荧光信号荧光信号激光束聚焦激光束聚焦鞘液鞘液液流系统和光学系统液流系统和光学系统样品流样品流光学系统、样品激发和光学系统、样品激发和FSC检测检测光学系统、样品

4、激发和光学系统、样品激发和SSC检测检测光学系统、样品激发和荧光检测光学系统、样品激发和荧光检测光学系统和荧光检测光学系统和荧光检测 （三）分选工作原理（三）分选工作原理 单细胞流 流动室 超声压电晶体高频振动 散射光 单细胞液滴 选定细胞群体 荧光信号 加载电荷 偏转高压静电场 液滴偏转 进入分选收集管，完成细胞分选 数据储存，分析。细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电分选的技术分选的技术要求：要求：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占

5、所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。二、量化成像分析流式细胞仪二、量化成像分析流式细胞仪（一）基本（一）基本结构结构量化成像分析流式细胞仪（imaging flow cytometer）的组成：荧光显微成像的形态学量化分析系统与经典流式细胞仪的结合体。液流系统：注射泵、流动室、鞘液流和细胞流 LED灯 明场细胞显微图像 光学系统：荧光显微系统 全固态激光器 流式细胞仪检测 检测系统：TDI CCD（二）分析工作原理（二）分析工

6、作原理细胞悬液 注射泵 流动室 液流聚焦系统鞘液 LED照射极限层流 抑制细胞搏动、翻转 明视野细胞形态 固态激光 TDI CCD捕获信号 散射光和荧光信号 计算机分析系统 细胞明视野、荧光图像和流式分析图量化成像分析流式细胞仪结构、原理量化成像分析流式细胞仪结构、原理 A.量化成像分析流式细胞仪结构图B.量化成像分析流式细胞仪结果分析图细胞核转位检测细胞核转位检测三、质谱流式细胞仪三、质谱流式细胞仪（一）基本（一）基本结构结构质谱流式细胞仪（mass cytometer）的组成质谱流式细胞仪是经典的流式技术和质谱技术的结合体。进样雾化系统离子源：热气化室和电感耦合等离子体焰炬 离子传递和过滤

7、系统ICP-TOF检测系统计算机及其分析系统质谱流式细胞仪结构简图质谱流式细胞仪结构简图（二）分析工作原理（二）分析工作原理 金属元素偶联抗体 标记细胞 进样器 雾化系统 单细胞雾化液滴 离子源 原子电离 带电粒子 高频交变电磁场 雪崩式放电 涡流电流 离子云形成 ICP-TOF检测 计算机系统 数据处理和分析 经典流式细胞仪图质谱流式细胞仪工作原理质谱流式细胞仪工作原理 质谱流式常用标记元素质谱流式常用标记元素常用外周血抗常用外周血抗CD分子抗体标记元素分子抗体标记元素质谱流式细胞仪结果分析质谱流式细胞仪结果分析第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析一、参数一、参数流式细胞仪的主要参

8、数有两大类流式细胞仪的主要参数有两大类：散射光信号：前向散射光和垂直散射光荧光信号：各种不同的流式细胞仪可检测的荧光信号数量不同，随着配置的激光器越多，可检测的荧光信号越多。分析型流式细胞仪最高标配4个激光器（488、633、405和375 nm），可检测20个参数（18种荧光），而定制型可配置11个激光器，30个检测器，可测定 32个参数。大型分选型流式细胞仪最高可配置7个激光器，检测24个参数（22种荧光），可6路分选。二、散射光的测定二、散射光的测定（一）前向散射光（forward scattered light，FSC）是与细胞切线方向小角度散射光，其能反映细胞形状和体积大小。二、散射

9、光的测定二、散射光的测定（二）侧向散射光或垂直散射光（side scattered light，SSC）激光照射到细胞内容物时，可以产生方向不同和强弱不等的散射光，垂直方向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映被检测细胞内精细结构和颗粒信息。三、荧光测量三、荧光测量（一）荧光信号测量与放大器 荧光信号由被检细胞上标记的荧光抗体上的荧光素受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。散射光和荧光的强度决定了峰值脉冲信号的高度，荧光的分布则决定了脉冲信号的宽度。这些光谱通过滤光片，不同波长的散射光和荧光信号被分开，经PMT和PD检测后，信号经放大、转换，最后通过计算机分析获取流式结果。

10、流式检测示意图流式检测示意图（二）荧光补偿荧光补偿是指不同的荧光素由于发射光谱重叠，因此在检测的时候有串色现象，通过减去重叠部分的光，使检测器检测到的光能量是真正的某一荧光素产生的光能量。四、数据显示方式四、数据显示方式（一）单参数数据的显示单维参数（荧光或散射光）与细胞数量（count）构成，用于FSC、SSC和荧光（FL1FLn）等单参数的数据显示。（二）双参数图 二维散点图、密度图和等高图（三）多维参数的显示假三维图和三参数点图 三参数以上的显示 主要要依据设门技术进行分析（四）设门分析技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要

11、求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。R3=Q1+Q2+Q3+Q4Q1=CD4+/CD3-Q2=CD4+/CD3+Q3=CD4-/CD3-Q4=CD4-/CD3+R1=为粒细胞为粒细胞R2=单核细胞单核细胞R3=淋巴细胞淋巴细胞M1为线性门，为是为线性门，为是R3中的中的T淋巴细胞淋巴细胞第三节第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、实验基本原则一、实验基本

12、原则FCM试验中实验设计、对照设置、荧光抗体的选择、标本处理、染色过程和质量控制都对实验结果又重要影响。标本处理实验室环境 临床标本处理的实验室环境以及废弃物的处理要严格按照实验室安全要求进行，对于传染病标本应该按照传染病的等级，按照病原微生物实验室生物安全管理条例规定在不同等级的实验室中进行。工作人员按要求穿戴相关的防护服，仪器消毒、排放的气体、废水和实验废弃物也应按照要求进行处理。活细胞分选应该在万级层流室中进行。二、单细胞免疫标本的制备二、单细胞免疫标本的制备（一）标本采集、运输、保存和操作1标本来源 主要来源于外周血、骨髓和淋巴器官或组织等。2抗凝剂的选择 采用肝素钠和EDTA-Na2

13、抗凝。EDTA的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成的细胞损失，具有较强的抗血小板聚集能力。缺点是由于EDTA具有一定的消化能力，导致细胞表面的一些分子丢失。枸橼酸钠和肝素锂不宜使用。3标本的保存新采集标本保存于室温，分离的单个核细胞标本保存于28。肝素抗凝外周血标本于室温保存48小时，EDTA抗凝的血标本保存24小时，骨髓标本室温保存18小时。最理想的保存方法，既要保持细胞原有的特性，又要不影响检测结果。常用保存方法：深低温保存法，乙醇或甲醇保存法，甲醛或多聚甲醛保存法。（二）标本制备1外周血和骨髓1)裂解红细胞是首选方法。2)密度梯度离心 在科学研究中首选。2体液 包括胸水、腹水、心包液、脑脊

14、液和脏器的灌洗液。3 培养细胞 蛋白酶消化 机械吹打 贴壁细胞脱落洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液。4 组织 机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法多方法组合制备单细胞悬液。二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色（一）常用的荧光染料和荧光蛋白能量传递复合染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。FITCPEPE-cy5Pre-CpAPCFL-1FL-2FL-3FL-4激光激光细细胞胞悬悬液液名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫氰

15、酸荧光素FITC488绿 525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料PE-cy5488红670易不敏感减少交叉，成本高能量传递复合染料机制PECY5CY5CY5488 nm575 nm670 nm 红色荧光花青苷5藻红蛋白名称名称染料染料激发激发波长波长荧光荧光颜色颜色溶解性溶解性对对PH敏敏感性感性特点特点异硫氰酸异硫氰酸荧光素荧光素FITC488绿绿 525易易敏感敏感易溶于水，与抗体易溶于水，与抗体结合不影响特异性结合不影响特异性藻红蛋白藻红蛋白PE488橙橙575易易不

16、敏感不敏感具较多发光基团，具较多发光基团，消光系数和量子产消光系数和量子产额高额高别藻青蛋别藻青蛋白白APC633红红670能量传递能量传递复合染料复合染料PE-cy5488红红670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高（二）免疫荧光标记荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法直接标记：干扰少，但需购买多种单抗，在流式分析中大量使用。间接标记：步骤多，干扰多，不需标记多种抗体组合标记。在流式标记中很少使用。抗体和标记方式的抗体和标记方式的选择选择首选直接标记抗体荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，荧光较弱，适

17、用于强表达抗原间接标记：不提倡用实验对照的设计原则实验对照的设计原则空白对照：所有试验必须设置阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时CBACBA 技术技术+抗原（细胞因子）抗原（细胞因子）荧光标记抗体荧光标记抗体捕获荧光微球捕获荧光微球捕获抗体捕获抗体荧光微球荧光微球三、基于免疫微球技术的应用三、基于免疫微球技术的应用不同荧光不同荧光强度微球强度微球CBA流式检测结果和标准曲线流式检测结果和标准曲线第四节第四节 流式细胞分析的临床应用流式细胞分析的临床应用 流式细胞术目前已广泛地被应用于基础研究、临床诊断和研究应用各

18、方面，特别是在免疫细胞的表型、功能分析和免疫相关性疾病的诊断、治疗和预后判断中具有重要的意义。一、机体免疫状态的检测一、机体免疫状态的检测（一）淋巴细胞及其亚群的分析1T淋巴细胞及其亚群 Th(CD3+CD4+CD8-T)：Th1、Th2、Th17、Th22Tc(CD3+CD4-CD8+T)Treg（CD3+CD4+CD8+T）2B细胞及其亚群 B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关。B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体；活化的B细胞可表达CD83。3 NK细胞分析 NK(CD3-CD16+CD56+)4树突状细胞

19、浆细胞样树突状细胞（lymphoid dendritic cell，LDC）：CD11c-CD33dimHLA-DR+Lineage-CD123+髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，mDC）：CD11c+HLA-DR+Lineage dim/-（二）淋巴细胞功能分析1淋巴细胞增殖试验：CFSE标记法 2CD8+T和NK细胞介导细胞毒性试验：FDA或CFSE标记法 3特异性CD8+T细胞功能的检测：MHC-抗原肽四聚技术（MHC-peptide tetramer assay）4淋巴细胞胞内细胞因子的检测：5细胞外细胞因子的检测：CBA技术二、造血系统二、造血系统CD及白

20、血病免疫分型及白血病免疫分型 T淋巴细胞系：CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8和TCR；B淋巴细胞系：CD10、CD19、CD20、CD22、CD79a和SmIg；NK淋巴细胞系：CD16、CD56和CD57；髓系：CD13、CD14、CD15、CD16、CD64、CD33、CD117、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）；红系：CD71和血型糖蛋白（glycophorin A，GlyA）；巨核系：CD41、CD42和CD61；干祖系及非系列相关抗原：CD34、CD38和HLA-DR。微小残留病变三、肿瘤耐药相关蛋白分析三、肿瘤耐药相关蛋白分析多药耐药基

21、因（multiple-drug resistance gene，MDRG）及其相关蛋白的检测：ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）蛋白转运蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）多药耐药蛋白1（MRP1，也是ABC转运蛋白超家族成员）肺耐药相关蛋白（lung resist protein，LRP）胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase-pi，GST-）乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）多药耐药相关蛋白2（MRP2）四、艾滋病检测中的应用四、艾滋病检测中的应

22、用除了病原体以外，需要对机体进行免疫状态评估：1.早期Th细胞绝对数显著下降，而Tc细胞数量可正常或相对增加。2.晚期CD4+T细胞和CD8+T细胞都明显下降。NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。五、自身免疫病中的应用五、自身免疫病中的应用淋巴细胞群体和亚群的检测：T细胞群体：CD3+T细胞 ，活化T细胞 ，CD8+T细胞 ，并 伴有CD4/CD8比值异常。循环Th17、Tfh和CD8+CD28+Tc及靶器官中的Th17 ，而Treg 和CD8+/CD28-T细胞总数和功能 ；B细胞群体：CD19+B细胞和CD83+B细胞 。此外在自身免 疫病中CD95+细胞比例 。自身免疫病

23、的检测标志检测：HLA-B27等检测。六、移植免疫中的应用六、移植免疫中的应用（一）移植前的配型和其它检测 1FCXM 2群体反应性抗体的检测 3造血干/祖细胞计数 4淋巴细胞计数和移植物抗宿主排斥病的预防（二）移植后的实验室监测各种与固有免疫和获得性免疫应答相关的分子、移植后并发的传染病相关分子的检测。第五节第五节 影响流式细胞分析的主要因素影响流式细胞分析的主要因素（一）体液或血液来源标本:尽可能即刻处理标本。要注意临床疾病对标本的影响。（二）培养细胞标本:酶和EDTA等消化对膜分子有一定影响。注意细胞处理过程对检测项目的影响。（三）实体组织来源标本:应按照组织器官的性质不同，选择合适的制

24、备单细胞悬液的方法，防止死细胞过多，胞膜分子丢失。（四）pH值:以7.07.2为宜。一、标本采集和制备的质量控制一、标本采集和制备的质量控制（一）细胞浓度:细胞浓度以1106/ml为宜。（二）对照设置：根据检测要求应设置空白、同型IgG和阳性对照。（三）封闭剂:FcR高丰度细胞，应进行封闭。（四）避光染色（五）操作温度:通常可室温，对于科学研究推进4染色。（六）洗涤和过滤:5%NCS PBS洗涤。采用200目筛网过滤。（七）结果判定：去除空白和同型对照的本底。（八）胞膜和胞内染色:先染胞膜，后染胞内。二、荧光染色过程中的质量控制二、荧光染色过程中的质量控制（一）调整仪器状态至最佳:采用标准微球

25、和样品进行仪器校正，确保激光光路与样品流处于正交状态，PMT处于灵敏状态，减少变异（CV）。（二）正确使用补偿：根据包括激光器的衰减等具体情况，正确使用补偿校正。三、仪器的质量控制三、仪器的质量控制（一）数据采集：每个标本应获取（12）104以上的有核细胞的数据；细胞周期检测时应收集3104以上的细胞，白血病MRD检测时应收集5104以上的细胞。建议收集细胞信号时采用无门的数据。（二）数据分析：当标本中细胞碎片或粘连过多，为所测细胞数2%以上，直方图的基线抬高时，应放弃分析处理。DNA倍体分析时，异倍体细胞数占总细胞数10%以下时，需要结合其它诊断指标。至少异倍体细胞占总细胞数的20%以上，可

26、以确定异倍体的存在。四、数据采集和分析的质量控制四、数据采集和分析的质量控制重点提示重点提示三种流式细胞仪的基本结构、基本原理。主要适用范围及优缺点。流式细胞术对样品分析及结果展示的形式，及展示方式的优缺点。流式细胞术分析的对标本制备、荧光抗体选择和染色的基本要求。流式细胞术的应用。流式细胞术的质量控制。本章小结本章小结流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。FSC反映颗粒的大小；SSC反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光强度与抗原分子表达丰度相关。标本处理尽可能减少细胞损伤；同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，十分重要。FCM在免疫相关性基本中应用广泛。对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。