临床免疫学检验-课件-第15章-免疫细胞标志和功能检测技术.pptx

1、第十五章第十五章 免疫细胞标志和功能免疫细胞标志和功能检测技术检测技术免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞:凡是参与免疫应答或与免疫应答有关凡是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞的统称为免疫细胞的细胞的统称为免疫细胞。淋巴细胞淋巴细胞T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞细胞抗原提呈细胞抗原提呈细胞单核巨噬细胞、树突状细胞等单核巨噬细胞、树突状细胞等其他细胞其他细胞中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞等胞和肥大细胞等3免疫细胞的分离及检测免疫细胞的分离及检测检测：检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定

2、方法：方法：体外法为主体外法为主目的：目的：判断机体免疫状态判断机体免疫状态意义：意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效免疫细胞的分离免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从是指将各种参与免疫反应的细胞从 血液或组织中分离出来血液或组织中分离出来 细胞分离基本原理细胞分离基本原理细胞密度不同细胞密度不同细胞生物学特性不同细胞生物学特性不同细胞表面分化抗原不同细胞表面分化抗原不同第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T、B B细胞和细胞和T T细胞亚群的分离细胞亚群的分

3、离一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）包括包括淋巴细胞淋巴细胞和和单单核细胞核细胞（monocyte）。）。分离原理分离原理：根据比重不同进行分离：根据比重不同进行分离 PBMC血小板血小板多核白细胞多核白细胞红细胞红细胞 对分离介质的要求：对分离介质的要求：对细胞无毒；对细胞无毒；基本等渗；基本等渗；与血浆和分离细胞不相溶；与血浆和分离细胞不相溶；有特定的比重。有特定的比重。不同动物的不同动物的PBMC比重有差异：比重有差异：小鼠：小鼠：1.085 大鼠：大鼠：1.

4、087 人：人：1.0751.090 常用常用Ficoll分离液分离液(1.0770.001)分离人的分离人的PMBC分离介质分离介质是关键是关键 Ficoll Ficoll分离液分离液份份6%6%聚蔗糖蒸馏水溶液聚蔗糖蒸馏水溶液份份34%34%泛影葡胺生理盐水溶液泛影葡胺生理盐水溶液(聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺）Ficoll外周血外周血纯度达纯度达95%上层：血浆上层：血浆中层：分离液中层：分离液底层：红细胞和多核细胞底层：红细胞和多核细胞白膜层白膜层二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 ，将已制

5、备的单个核，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，3737温箱静置温箱静置1 h1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞。为纯淋巴细胞。橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞。1.1.贴壁黏附法贴壁黏附法PBMC37 1 hour上清液上清液单核单核单核单核淋巴细胞淋巴细胞注意：注意：B B细胞也可粘附细胞也可粘附 ，将单个核细胞悬液注入装有玻璃，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G1

6、0Sephadex G10的层的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。脱下来的细胞主要是淋巴细胞。2.2.吸附柱过滤法吸附柱过滤法PBMCPBMC洗洗 脱脱 洗脱液洗脱液淋巴细胞淋巴细胞巨噬细胞或单核细胞巨噬细胞或单核细胞 DC B细胞细胞 T细胞细胞=红细胞红细胞细胞的黏附能力：细胞的黏附能力：3.Percoll 3.Percoll 分离液连续密度梯度离心法分离液连续密度梯度离心法 是一种经聚乙烯吡咯烷酮是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(PVP)处理的处理的硅胶颗粒硅胶颗粒

7、，对细，对细胞无毒性。胞无毒性。高速离心后可形成连续的密高速离心后可形成连续的密度梯度，不同密度的细胞将度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离从而将密度不等的细胞分离纯化。纯化。死细胞死细胞 血小板血小板单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞粒细胞粒细胞红细胞红细胞操作流程长，繁琐，实际应用受限操作流程长，繁琐，实际应用受限 红细胞红细胞 低渗裂解法：在低渗裂解法：在PBMC中加入蒸馏水，轻摇中加入蒸馏水，轻摇片刻使红细胞裂解，随后加入等量的片刻使红细胞裂解，随后加入等量的1.8%氯化钠溶液恢复等渗。氯化钠溶液恢复等渗。血小板血小板 胎牛

8、血清梯度离心，利用胎牛血清梯度离心，利用PBMC与血小板比与血小板比重的差异，离心后重的差异，离心后PBMC沉淀、血小板悬浮沉淀、血小板悬浮。其他成分去除其他成分去除淋巴细胞淋巴细胞T细胞：细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等等B细胞：细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等等分离方法分离方法阳性选择法：纯化所需的细胞阳性选择法：纯化所需的细胞阴性选择法：去除不要的细胞，留下所需细胞阴性选择法：去除不要的细胞，留下所需细胞三、三、T T、B B细胞和细胞和T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离E E花环沉淀法花环沉淀法尼龙毛纤维分离法尼龙毛纤维分离法磁性微球分离法磁性微

9、球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法亲和板分离法亲和板分离法三、三、T T、B B细胞和细胞和T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离E E花环沉淀法花环沉淀法尼龙毛纤维分离法尼龙毛纤维分离法亲和板分离法亲和板分离法磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法1.E花环沉淀法花环沉淀法方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞+SRBC悬液悬液加入分层液加入分层液 T细胞形成细胞形成E花环而沉于管底花环而沉于管底悬液悬液 中为中为B细胞。细胞。成熟成熟T细胞具有细胞具有CD2分子分子能结合绵羊红细胞能结合绵羊红细胞缺点：分离效率低，易受多种因素影响缺点：分离

10、效率低，易受多种因素影响方法：将所需的细胞对应的单克隆方法：将所需的细胞对应的单克隆 抗体包被于小管内抗体包被于小管内加入淋加入淋 巴细胞巴细胞形成形成Ag-Ab复合物复合物 洗去不反应的物质。洗去不反应的物质。2.尼龙毛分离法尼龙毛分离法(吸附能力差异吸附能力差异)方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维管通过聚酰胺纤维管洗脱下来的是洗脱下来的是T细胞细胞3.亲合板结合分离法亲合板结合分离法分离亚群分离亚群4.磁性微球分离法磁性微球分离法磁性微球：磁性微球：微球核心一般为金属小颗粒（微球核心一般为金属小颗粒（Fe2O3,Fe3O4)，其表面包裹有高分子材料（聚苯乙烯，其表面包裹有高分子材料

11、（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。核酸等）。免疫磁珠：免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠，微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠，有有免疫配基免疫配基和和磁响应磁响应的性质。的性质。正筛选细胞时，抗体可引起细胞凋亡或活化。正筛选细胞时，抗体可引起细胞凋亡或活化。细胞细胞-抗体抗体-磁珠复合物磁珠复合物免疫磁珠法分离细胞原理免疫磁珠法分离细胞原理评价免疫磁珠分离细胞的重要指标：评价免疫磁珠分离细胞的重要指标：纯度和得率纯度和得率取决于：取决

12、于：磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对细胞造成机械压力，对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不影响其生物学活性，不利于分离后培养利于分离后培养对细胞温和，不影响对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养分离细胞的后续培养对流式细胞仪对流式细胞仪的影响的影响阻塞喷嘴，影响散射光阻塞喷嘴，影响散射光可直接上流式细胞仪可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光检测，不影响散射光分离条件要求分离条件要求技术简单，分离可在试技术简单，分离可在试管中完成管中完成需要很强的磁场来分需要很强的磁场来分离细胞离细胞收率收率得率

13、高得率高得率不高得率不高纯度纯度纯度低纯度低纯度高纯度高分离时间分离时间分离速度快分离速度快分离速度慢分离速度慢分离成本分离成本成本低成本低需要很强的磁场，需需要很强的磁场，需要一次性的分离柱，要一次性的分离柱，不能在普通试管进行不能在普通试管进行经典的流式经典的流式细胞分析仪细胞分析仪5.荧光激活荧光激活细胞分选仪细胞分选仪分离法（分离法（FACS）优点：可对单个细胞进行快速、准确和客观的检测，对优点：可对单个细胞进行快速、准确和客观的检测，对特定群体加以分选特定群体加以分选缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和 仪器昂贵仪器昂贵什么

14、是流式细胞仪什么是流式细胞仪?流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometerflow cytometer）：）：是多学科交叉融合的产物，是集光学、化学、材料学、流体力学、自动化控制、光电测量、细胞生物学、生物化学、免疫学和计算机图像分析等技术于一体的现代化新型分析仪器。作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分作为一种先进的微粒（细胞）定性和定量分析仪器析仪器。流式细胞仪特点：流式细胞仪特点：速度快，每秒可测量数万个微粒；精度高；准确性好；多参数测量，可以同时对同一个微粒作物理、化学和生物特性的多参数测量。经典流式细胞仪的结构经典流式细胞仪的结构（一）基本结构一）基本结构 经典分选型的流式细胞

15、仪的结构组成液流液流系统系统：液流驱动系统、流动室、鞘液流和标本流 光学系统：光学系统：光源、光束形成器（流动室前光学系统）、流动室后光学系统 信号检测及光电转换系统信号检测及光电转换系统：光电转换器、放大器和信号处理电路 分选分选系统系统：电荷加载系统、超声压电晶体、液流断点监控系统、偏转电极、细胞收集系统和气溶胶控制系统计算机计算机分析系统分析系统 经典流式细胞仪的结构经典流式细胞仪的结构细胞悬液形成液流柱流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴弃去偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电流式细胞仪分选原理流式细胞仪分选原理流式细胞术分选的流式细胞术分

16、选的原理原理早期早期细胞物理细胞物理属性属性细胞生物细胞生物属性属性分辨率和灵敏度不高分辨率和灵敏度不高现在（根据细胞表面标志）现在（根据细胞表面标志）免疫磁珠免疫磁珠流式细胞仪流式细胞仪分辨率分辨率和灵敏和灵敏度高度高四、不同细胞分离方法的综合评价四、不同细胞分离方法的综合评价1、细胞计数、细胞计数单位：细胞数单位：细胞数/毫升。毫升。工具：血细胞计数板工具：血细胞计数板 方法：分离的免疫细胞悬液轻轻混匀后，取一定体方法：分离的免疫细胞悬液轻轻混匀后，取一定体积细胞悬液加等量的细胞稀释液混匀，吸取积细胞悬液加等量的细胞稀释液混匀，吸取1滴滴入滴滴入血细胞计数板中，计算血细胞计数板中，计算4个

17、大方格的细胞数。个大方格的细胞数。细胞数细胞数=4个大方格的细胞数个大方格的细胞数4104 稀释倍数稀释倍数五、五、分离分离细胞的保存和活力检测细胞的保存和活力检测4个大方格，个大方格，体积为体积为0.1mm32、分离细胞的保存、分离细胞的保存 对保存液的要求：等渗，具对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并缓冲作用，并对细胞无毒性（对细胞无毒性（Hanks、Tc-199、RPMI 1640）。）。短期保存，置短期保存，置4放置较好，可减低细胞代谢放置较好，可减低细胞代谢活动。活动。需长期保存，应放入液氮罐中在深低温需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(-196)条件下保存细胞。条件下保存细胞

18、。3、细胞活力测定、细胞活力测定 细胞活力常用细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比活细胞占总细胞的百分比表示，表示，常用常用台盼蓝台盼蓝(trypan blue)染色法。死细胞着色，染染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。成蓝色；活细胞拒染。用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数色的细胞，计数200 个细胞，以不着色细胞的百分个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。率即代表细胞的活力。一、T细胞表面标志及亚群细胞表面标志及亚群二、B细胞表面标志细胞表面标志三、自然杀伤细胞表面标志三、自然杀伤细胞表面标志第二节第二节 淋巴细胞表面标

19、志的检测及亚群分类淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 白细胞分化抗原：造血干细胞在分化为不同谱系、各个细白细胞分化抗原：造血干细胞在分化为不同谱系、各个细胞谱系分化不同阶段、及成熟细胞活化过程中表达的细胞胞谱系分化不同阶段、及成熟细胞活化过程中表达的细胞表面分子；表面分子；簇分化抗原（簇分化抗原（cluster of differentiation）：）：CD分子或分化分子或分化群，通常鉴定的同一白细胞分化抗原归为同一分化群；群，通常鉴定的同一白细胞分化抗原归为同一分化群；淋巴细胞鉴定和计数常用的细胞表面标志：淋巴细胞鉴定和计数常用的细胞表面标志：簇分化抗原簇分化抗原(CD)；相关概念相关概念一

20、、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 T细胞共同的标志抗原：细胞共同的标志抗原：CD3分子分子根据免疫效应功能和表面的根据免疫效应功能和表面的CD分子分为：分子分为：辅助性辅助性T细胞（细胞（help T cell,Th）：）：CD3+CD4+CD8-细胞毒性细胞毒性T细胞（细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL）：CD3+CD4-CD8+调节性调节性T细胞（细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）：）：CD4+CD25+Foxp3+（一）辅助性（一）辅助性T细胞（细胞（help T cell,Th）典型标志：典型标志：CD3+CD4

21、+CD8-主要包括主要包括Th1、Th2、Th3和和Th17细胞细胞 Th1和和Th2相对特异的标志：相对特异的标志：CD3+CD4+CD30-（Th1）CD3+CD4+CD30+（Th2）一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 分泌分泌IL-2、IFN-、TNF-辅助细胞辅助细胞免疫免疫分泌分泌IL-4、5、6、10，辅助体液免疫辅助体液免疫（二）细胞毒性（二）细胞毒性T T细胞细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL）典型标志：典型标志：CD3+CD4-CD8+Tc1和和Tc2相对特异的标志：相对特异的标志：CD3+CD8+CD30-（Tc1）CD3+CD

22、8+CD30+（Tc2）一、一、T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群（三）调节性（三）调节性T细胞细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）分两类：分两类：自然调节性自然调节性T细胞（细胞（natural Treg，nTreg）诱导性调节性诱导性调节性T细胞（细胞（inducible Treg，iTreg）分子标记：转录因子分子标记：转录因子Foxp3；nTreg的典型标志：的典型标志：CD4+CD25+Foxp3+iTreg的检测要结合其他的检测要结合其他T细胞标志。细胞标志。一、一、T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 二、二、B B细胞表面标志细胞表面标

23、志 mIg、Fc受体、补体受体、受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体等，病毒受体、小鼠红细胞受体等，其中其中以以mIg为为B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标；细胞可靠的指标；其他特异的分子有：其他特异的分子有：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等等；CD19/CD5分子：可将分子：可将B细胞区分为细胞区分为B1细胞和细胞和B2细胞细胞，B1细细胞为胞为CD19+CD5+，而，而B2细胞为细胞为CD19+CD5-。B2细胞为通常细胞为通常所指外周成熟的所指外周成熟的B细胞细胞。B1与与B2细胞的比较细胞的比较2CD19CD19+CD5CD5-:B2:B2

24、细胞细胞mIgmIg：膜表面免疫球蛋白：膜表面免疫球蛋白CD19CD19（B B细胞的标志）细胞的标志）CD21 CD22 CD23CD21 CD22 CD23CD32(FcR)CD32(FcR)CD35CD35（C3b/C4bC3b/C4b受体）受体）CD40CD40（成熟（成熟B B细胞）细胞）CD80/86CD80/86（活化的（活化的B B细胞）细胞）CD19CD19+CD5CD5+:B1:B1细胞细胞二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 B细胞特有，鉴定细胞特有，鉴定B细胞可靠指标细胞可靠指标成熟成熟B细胞共有细胞共有Fc受体受体补体受体补体受体三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面

25、标志 人类人类NK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NK细胞。细胞。抗原提呈细胞（抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），分两类：），分两类：专职提呈细胞专职提呈细胞：巨噬细胞、树突状细胞、：巨噬细胞、树突状细胞、B细胞，细胞，表达表达MHC II类分子；类分子；非专职提呈细胞非专职提呈细胞：内皮细胞、上皮细胞等：内皮细胞、上皮细胞等 其他：表达其他：表达MHC-类分子类分子 能提呈内源性抗原能提呈内源性抗原的细胞的细胞第三节第三节 抗原提呈细胞表面标志的

26、检测抗原提呈细胞表面标志的检测1、单核、单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统 主要表面标志：主要表面标志：CD142、树突状细胞（、树突状细胞（DC）形态、表型和功能高度异质；形态、表型和功能高度异质；共同特征：树突样形状，胞质存在共同特征：树突样形状，胞质存在Birbeck颗粒状结构、颗粒状结构、表达表达CD1a、MHC II类分子、吞噬功能低、诱导静息类分子、吞噬功能低、诱导静息幼稚幼稚T细胞增殖细胞增殖；主要表面标志：主要表面标志：CD1a、CD11c、CD83。第三节第三节 抗原提呈细胞表面标志的检测抗原提呈细胞表面标志的检测第四节第四节 淋巴细胞功能检测淋巴细胞功能检测一、一、T淋巴细胞功

27、能的检测淋巴细胞功能的检测T细胞功能：细胞功能：对外来物质的应答功能对外来物质的应答功能 直接杀伤特异性靶细胞直接杀伤特异性靶细胞 辅助或抑制辅助或抑制B细胞产生抗体细胞产生抗体 产生细胞因子功能产生细胞因子功能 分为分为体内实验体内实验和和体外实验体外实验。体内实验：体内实验：间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应，如迟发型超敏反应。有丝分裂原的应答反应，如迟发型超敏反应。体外实验体外实验：包括：包括增殖反应增殖反应、细胞毒性试验细胞毒性试验及及淋巴淋巴细胞分泌产物细胞分泌产物的测定。的测定。一、一、T淋巴细胞功能的检测淋巴细胞功能的检测（一）（

28、一）T淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（T细胞转化试验）细胞转化试验）T细胞细胞外来物质外来物质细胞内大分子物质细胞内大分子物质的合成增加的合成增加T细胞形态变化细胞形态变化丝裂原：非特异性刺激物丝裂原：非特异性刺激物 PHA、ConA、PWM抗原性刺激物：抗原性刺激物：PPD (purified protein derivative)同位素法同位素法形态法形态法1、同位素法、同位素法(3H-TdR掺入法掺入法)外周血单个核细胞外周血单个核细胞5%CO2 37 56h+收集培养细胞于滤膜上收集培养细胞于滤膜上液体闪烁器计数液体闪烁器计数cpm加入加入3H-TdRPHA无无PHA37 16h计

29、算刺激指数计算刺激指数(stimulation index,SI)：SI =含含PHA管管cpm不含不含PHA管管cpm方法评价：方法评价：客观性较强，灵敏度高，重复性好客观性较强，灵敏度高，重复性好所需仪器昂贵所需仪器昂贵有同位素污染有同位素污染2、形态法、形态法标本：外周血或单个核细胞标本：外周血或单个核细胞37 72h+取培养细胞涂片染色镜检取培养细胞涂片染色镜检观察细胞形态学改变观察细胞形态学改变PHA无无PHA未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化细胞转化细胞未转化淋巴细未转化淋巴细胞胞淋巴母细胞淋巴母细胞过度型过度型细胞大小（直径细胞大小（直径m）1220

30、121668核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰，清晰，14有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞浆、着色胞浆、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少，天青色极少，天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无转化率转化率 =转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数未转化的淋巴细胞数100%计数计数200个淋巴细胞，求转化率个淋巴细胞，求转化率正常参考值：正常参考值：60%80%方法学评价：方法学评价：1)简便易行简便

31、易行2)受主观影响因素较大、重复性差受主观影响因素较大、重复性差3、MTT比色法比色法 是一种检测是一种检测细胞存活和生长细胞存活和生长的方法。的方法。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶还原还原不溶性蓝黑色结晶甲臜沉积不溶性蓝黑色结晶甲臜沉积酶标仪检测酶标仪检测A570nm淋巴细胞淋巴细胞丝裂原丝裂原MTTDMSO或盐酸或盐酸异丙醇溶解异丙醇溶解甲臜生成量与细胞增殖水平正相关甲臜生成量与细胞增殖水平正相关计算刺激指数计算刺激指数(stimulation index,SI)：淋巴细胞增值程度：淋巴细胞增值程度SI =试验孔试验孔A570nm均值均值 对照孔对照孔A570nm均值均值方法学评价：方法学评价：

32、1)简便易行，无放射性污染简便易行，无放射性污染2)灵敏度相对较低灵敏度相对较低（二）（二）T淋巴细胞分泌功能测定淋巴细胞分泌功能测定细胞因子检测细胞因子检测（三）（三）T淋巴细胞介导的细胞毒试验淋巴细胞介导的细胞毒试验T细胞细胞靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞37靶细胞被杀灭靶细胞被杀灭(lymphocyte mediated cytotoxicity，LMC)1、形态学检查法、形态学检查法镜检镜检抑制率抑制率%=对照组平均残留肿瘤细胞数对照组平均残留肿瘤细胞数 实验组平均残留肿瘤细胞数实验组平均残留肿瘤细胞数对照组平均残留肿瘤细胞数对照组平均残留肿瘤细胞数100%2、同位素法（、同位素法（51Cr

33、释放法）释放法）靶细胞靶细胞37靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞T细胞细胞51Cr透过细胞膜与胞浆蛋白质结合透过细胞膜与胞浆蛋白质结合51Cr同位素释放同位素释放靶细胞被杀灭靶细胞被杀灭检测靶细胞的放射性强度检测靶细胞的放射性强度51Cr（四）（四）体内试验体内试验注射注射OT2448h根据硬结直根据硬结直径判断阳性径判断阳性二、二、B淋巴细胞功能检测淋巴细胞功能检测产生抗体功能产生抗体功能对外来物质应答功能对外来物质应答功能(B细胞增殖能力细胞增殖能力)IgM诱导增殖试验诱导增殖试验LPS诱导增殖试验诱导增殖试验葡萄球菌诱导试验葡萄球菌诱导试验血清血清Ig的测定的测定体内试验体内试验溶血空斑形成试验

34、溶血空斑形成试验（一）体内试验（一）体内试验适量抗原适量抗原白喉类毒素、白喉类毒素、破伤风类毒素破伤风类毒素待检者待检者检测待检者血清中相应抗体的效价检测待检者血清中相应抗体的效价（二）溶血空斑形成试验二）溶血空斑形成试验 检测动物抗体形成细胞的功能检测动物抗体形成细胞的功能SRBC取出脾细胞，取出脾细胞，加入加入SRBC及补体及补体4天天47 0.7%琼脂溶液琼脂溶液37 3-5h 1、直接溶血空斑形成试验、直接溶血空斑形成试验 溶血溶血SRBC抗抗SRBC抗体补体复合物抗体补体复合物导致导致SRBC溶解溶解形成溶血空斑形成溶血空斑一个溶血空斑表示一个抗体形成细胞一个溶血空斑表示一个抗体形成

35、细胞 溶血空斑的大小表示抗体形成的量溶血空斑的大小表示抗体形成的量检测检测IgM生成细胞生成细胞2、间接溶血空斑形成试验：、间接溶血空斑形成试验：检测检测IgG、IgA生成细胞生成细胞SRBC取出脾细胞，取出脾细胞，加入加入SRBC及补体及补体4天天47 0.7%琼脂溶液琼脂溶液37加入抗鼠加入抗鼠Ig抗体抗体SRBC抗抗SRBC抗体抗小鼠抗体补体复合物抗体抗小鼠抗体补体复合物导致导致SRBC溶解溶解形成溶血空斑形成溶血空斑3、被动空斑形成试验、被动空斑形成试验 SRBC补体补体47 0.7%琼脂溶液琼脂溶液37抗原抗原 可检测人类抗体形成细胞的功能可检测人类抗体形成细胞的功能 待检血待检血

36、单个核细胞单个核细胞如果用一定方法将SRBC与其他抗原连接，则可检查与该抗原相应的抗体形成细胞，这种非红细胞抗体性溶血空斑试验，称为被动空斑形成试验。SRBC抗原与抗原相应的抗体补体复合物抗原与抗原相应的抗体补体复合物导致导致SRBC溶解溶解形成溶血空斑形成溶血空斑吸附吸附+4、反向空斑形成试验、反向空斑形成试验如用抗IgG、IgA、IgM抗体包被SRBC，检测相应的免疫球蛋白产生的细胞。抗IgG、IgA、IgM抗体SRBC抗抗体抗体补体复合物抗抗体抗体补体复合物导致导致SRBC溶解溶解形成溶血空斑形成溶血空斑 可检测人类抗体形成细胞的功能可检测人类抗体形成细胞的功能溶血空斑形成试验应用：溶血

37、空斑形成试验应用：1、测定药物或其它因素对体液免疫功能的影响、测定药物或其它因素对体液免疫功能的影响2、评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能、评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能（三）酶联免疫斑点试验（三）酶联免疫斑点试验可测抗体分泌细胞，又可测抗体分泌量可测抗体分泌细胞，又可测抗体分泌量具有稳定、特异、抗原用量少；具有稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌、可可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌、可定量；定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞三、自然杀伤细胞活性检测三、自然杀伤细胞活性检测NK细胞活性：既不依赖抗体，也不需

38、抗原刺细胞活性：既不依赖抗体，也不需抗原刺激和致敏就能杀伤靶细胞。激和致敏就能杀伤靶细胞。NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的受体细胞表面存在识别靶细胞表面分子的受体结构，通过受体直接与靶细胞结合发挥杀伤作结构，通过受体直接与靶细胞结合发挥杀伤作用。用。方法及原理：方法及原理：靶细胞靶细胞效应细胞效应细胞靶细胞死亡靶细胞死亡可被台可被台盼兰染色盼兰染色形态法形态法释放胞内酶释放胞内酶酶释法酶释法乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶简便易于操作简便易于操作可较早反应可较早反应NK活性活性受主观因素响大受主观因素响大无法计数轻微损伤的细胞无法计数轻微损伤的细胞可定量检测可定量检测简便简便本底高本底高同位素法同位素

39、法靶细胞靶细胞效应细胞效应细胞靶细胞死亡靶细胞死亡同位素同位素同位素释放同位素释放检测靶细胞的放射性强度检测靶细胞的放射性强度51Cr透过细胞膜与透过细胞膜与胞浆蛋白质结合胞浆蛋白质结合51Cr3HTdR3HTdR参与细胞参与细胞DNA合成合成第五节第五节 其他免疫细胞功能检测技术其他免疫细胞功能检测技术大吞噬细胞：单核巨噬细胞系统大吞噬细胞：单核巨噬细胞系统小吞噬细胞：中性粒细胞小吞噬细胞：中性粒细胞 吞噬细胞的吞噬活动大体分为吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内趋化、吞噬和胞内杀灭作用杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测一

40、、中性粒细胞功能检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能检测吞噬和杀菌功能检测(一一)细胞运动功能细胞运动功能趋化功能检测趋化功能检测1.1.原理：原理：趋化因子（微生物的代谢产物，补体片段趋化因子（微生物的代谢产物，补体片段C3aC3a和和C5aC5a，细胞因子，细胞因子)作用下，中性粒细胞产作用下，中性粒细胞产生趋化运动，其强度反映中性粒细胞的功能。生趋化运动，其强度反映中性粒细胞的功能。2.2.方法学：方法学：滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）琼脂糖平板法琼脂糖平板法 A：向左侧孔移动距离即趋向移动距离：向左侧孔移动距离即趋向移动距离B：向右侧孔移动

41、距离即自发移动距离：向右侧孔移动距离即自发移动距离趋化指数：趋化指数：A/B，判断移动距离，判断移动距离趋化因子趋化因子对照对照(二二)吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 中性粒细胞可吞噬颗粒性物质（如金中性粒细胞可吞噬颗粒性物质（如金黄色葡萄球菌），根据黄色葡萄球菌），根据吞噬率吞噬率(phagocytic rate)和吞噬指数和吞噬指数(phagocytic index)可判断可判断该细胞的吞噬功能，根据被吞噬的细菌是该细胞的吞噬功能，根据被吞噬的细菌是否着色测定否着色测定杀菌率杀菌率。1 1显微镜检查法：显微镜检查法：100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率100(%)计数的

42、白细胞数数胞内含着染菌体的细胞杀菌率 原理：原理：将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育后，涂片用碱性亚甲蓝液染色。在油镜下计数吞温育后，涂片用碱性亚甲蓝液染色。在油镜下计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数2.2.溶菌法溶菌法100min0min9060301(%)）菌落数菌落数或、作用（杀菌率 原理：原理：将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合后，置（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合后，置37。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体

43、平。每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基。板培养基。37培养培养18h后，计数生长菌落数，以了解后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。中性粒细胞的杀菌能力。3硝基蓝四氮唑硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)还原试验还原试验 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖戊糖戊糖6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶脱氢脱氢加入加入NBT吞噬或渗透到中吞噬或渗透到中性粒细胞胞质性粒细胞胞质蓝黑色甲臜颗粒蓝黑色甲臜颗粒还原还原沉积于中性粒细沉积于中性粒细胞胞质胞胞质NBT阳性细胞阳性细胞NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能

44、 方法评价：方法评价：正常值为正常值为40%50%，一般以阳性细胞数，一般以阳性细胞数超过超过10%判定为判定为NBT试验阳性。试验阳性。二、巨噬细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测 斑蝥敷贴法收集斑蝥敷贴法收集 检测溶酶体酶的活性检测溶酶体酶的活性酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 促凝血活性测定促凝血活性测定反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。预后监测。CD4/CD8CD4/CD8组织器官移植后对受者的细胞免疫学功组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测有利于排斥反应的早期发

45、现，以便能监测有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。及时采取有效措施。第六节第六节 免疫细胞标志和功能检测的临床应用免疫细胞标志和功能检测的临床应用小小 结结免疫细胞的分离免疫细胞的分离免疫细胞的计数免疫细胞的计数 PBMC分离：分离：细胞密度不同细胞密度不同 淋巴细胞分离：淋巴细胞分离：生物学特性不同生物学特性不同 T、B细胞和细胞和T细胞亚群分离：细胞亚群分离：细胞表面标志：免疫磁珠细胞表面标志：免疫磁珠 T细胞表面标志及亚群细胞表面标志及亚群：CD3+CD4+CD8-ThCD3+CD4-CD8+CTLCD4+CD25+Foxp3+TregCD30+/-,Th1/Th2；Tc1/

46、Tc2 B细胞表面标志细胞表面标志：mIg:特有特有CD19：成熟：成熟B细胞共有；细胞共有；CD19+CD5+：B1细胞；细胞；CD19+CD5-：B2细胞：体液免疫细胞：体液免疫 单核吞噬细胞表面标志单核吞噬细胞表面标志：CD14 树突状细胞树突状细胞：CD1a、CD11c、CD83荧光激活细胞分离仪计数荧光激活细胞分离仪计数免疫细胞功能检测免疫细胞功能检测小小 结结T细胞功能检测细胞功能检测T细胞增殖试验细胞增殖试验T细胞分泌功能细胞分泌功能T细胞介导细胞毒试验细胞介导细胞毒试验抗原皮肤试验抗原皮肤试验PHA皮肤试验皮肤试验体内试验体内试验形态学法形态学法同位素法同位素法MTT比色法比色

47、法形态学法、同位素法形态学法、同位素法B细胞功能检测细胞功能检测抗体生成能力检测抗体生成能力检测溶血空斑试验溶血空斑试验酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验直接法和间接法直接法和间接法测抗红细测抗红细胞抗体产生细胞胞抗体产生细胞被动法和反向法被动法和反向法测人类抗测人类抗体形成细胞体形成细胞NK细胞功能检测细胞功能检测形态学法、酶释放法、同位素法形态学法、酶释放法、同位素法中性粒细胞功能检测中性粒细胞功能检测趋化功能趋化功能吞噬和杀菌功能吞噬和杀菌功能滤膜渗透法滤膜渗透法琼脂糖平板法琼脂糖平板法显微镜检查法显微镜检查法溶菌法溶菌法NBT法法 T细胞均有共同的标志性抗原是细胞均有共同的标志性抗原是

48、分子？分子？B细胞表面最重要的标志是细胞表面最重要的标志是 。采用采用Ficoll分离法处理血清后，分离结果从上至下依分离法处理血清后，分离结果从上至下依次为次为 。利用贴壁粘附法可从利用贴壁粘附法可从PBMC中去除中去除 。用于吞噬和杀菌功能测定的方法有用于吞噬和杀菌功能测定的方法有 。思考题思考题1、PBMC的分离方法及原理？的分离方法及原理？2、淋巴细胞分离的方法有哪些？各有什么特点淋巴细胞分离的方法有哪些？各有什么特点？3、细胞表面标志的检测方法有哪些？细胞表面标志的检测方法有哪些？4、T细胞、细胞、B细胞、细胞、NK细胞、单核细胞的主要细胞、单核细胞的主要分化抗原是什么？分化抗原是什么？5、T细胞功能检测方法学及相应的原理有哪些？细胞功能检测方法学及相应的原理有哪些？思考题思考题