临床样本的采集运输和保存及核酸提取.ppt

1、临床样本的采集运输和保存及核酸提取-精品文档研究背景研究背景l 样本的采集、处理样本的采集、处理l 样本的保存样本的保存l 样本的运输样本的运输l DNADNA的提取的提取l RNARNA的提取的提取研究背景研究背景一、样本的采集、处一、样本的采集、处 理、保存及运输理、保存及运输（一）、样本的采集（一）、样本的采集地贫检测样品采集：地贫检测样品采集：l 外周血外周血:5mLl 脐带血脐带血:0.51mLl 羊羊 水：水：2030mLl 绒绒 毛：毛：15mgl 唾唾 液液l 组组 织织研究背景研究背景 二、核酸的提取二、核酸的提取细胞破碎方法细胞破碎方法 应用应用 机械法机械法1.1.匀浆法

2、匀浆法机体软组织机体软组织2.2.捣碎法捣碎法动物韧性组织动物韧性组织3.3.研磨法研磨法细菌、酵母细菌、酵母 物理法物理法1.1.超声法超声法细胞混悬液细胞混悬液2.2.反复冻融法反复冻融法培养细胞培养细胞3.3.冷热交替法冷热交替法细菌、病毒细菌、病毒4.4.低渗裂解低渗裂解红细胞红细胞 化学法化学法1.1.有机溶剂有机溶剂细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液2.2.去垢剂去垢剂组织、培养细胞、组织、培养细胞、血液血液3.3.酶解法酶解法细菌、酵母、血液细菌、酵母、血液(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）EB与DNA的结合A2

3、60/A280比值是纯度检测的重要指标！比值是纯度检测的重要指标！注：注：测定吸光值，稀释液应使用测定吸光值，稀释液应使用DNA完整性鉴定：完整性鉴定：正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解RNA完整性鉴定：完整性鉴定：抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80保存2个月，第10天收率90%4 第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差酚酚抽抽提提法法提提取取步步骤：骤：DNA酚抽提法示意图影响影响DNA质量的因素质量的因素组织材料组织材料起始样品量起始样品量T

4、otal RNA提取量提取量blood1ml1520gleukocytes110107 7个个约约100 gLiver tissue1g约约5000 gCulture cells110107 7个个约约100gRenal tissue1g约约3000gSkeleton tissue1g约约1500gCerebral tissue1g约约1500g1.内源性内源性RNA酶（酶（intrinsic RNase）OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用的过程中不使用DEPC