-感染性疾病的诊断.ppt
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- 感染性 疾病 诊断
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1、-感染性疾病的诊断 分子诊断的临床意义在于不仅能够分子诊断的临床意义在于不仅能够对疾病作出早期诊断、确切诊断,而且还对疾病作出早期诊断、确切诊断,而且还能确定个体归于疾病的易感性以及疾病的能确定个体归于疾病的易感性以及疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等。随着分期分型、疗效监测、预后判断等。随着分子诊断学的发展,分子诊断的原理和方分子诊断学的发展,分子诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾病,而且也广泛应法不仅适用于遗传性疾病,而且也广泛应用于感染性疾病、肿瘤等医学领域。用于感染性疾病、肿瘤等医学领域。从生物中心法则来看,分子诊断包从生物中心法则来看,分子诊断包括检测基因的结构异常和基因表达异常。
2、括检测基因的结构异常和基因表达异常。常见的分子诊断方法如下:常见的分子诊断方法如下:DNADNAmRNAmRNA蛋白质蛋白质转转 录录反转录反转录 翻翻 译译 PCRPCR DNADNA测序测序Southern-blotSouthern-blot基因芯片基因芯片基因结构异常基因结构异常基因表达异常基因表达异常RT-PCR RT-PCR FQ-PCRFQ-PCR Nothern-blot Nothern-blot 基因芯片基因芯片ELISAELISAWestern-blot Western-blot 组织化学染色组织化学染色蛋白质芯片蛋白质芯片中心法则中心法则检测方法检测方法第十四章第十四章感染
3、性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断生物化学与分子生物学学科生物化学与分子生物学学科2011.42011.4第一节第一节 概概 述述感染性疾病感染性疾病:由某种病原体所致,通过不:由某种病原体所致,通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。状的疾病。病原体病原体:病毒、细菌、原虫、支原体、:病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体。衣原体、立克次体。常规检测方法:常规检测方法:免疫学方法免疫学方法 微生物学方法微生物学方法 受敏感性、特异性限制,不易早期诊断,受敏感性、特异性限制,不易早期诊断,并且不易提供病原体分型及耐药性方面的并且不易提供病原体分
4、型及耐药性方面的信息。信息。分子生物学方法:分子生物学方法:聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCRPCR)核酸杂交核酸杂交 基因芯片基因芯片 早期、特异地进行诊断,能提供早期、特异地进行诊断,能提供病原体分型及耐药性方面的信息,同时进行病原体分型及耐药性方面的信息,同时进行大量基因的检测。大量基因的检测。一、一、感染性疾病的分子诊断,其诊断感染性疾病的分子诊断,其诊断策略可以分为以下两种:策略可以分为以下两种:一般性检出策略一般性检出策略,即只需要提供是否有,即只需要提供是否有某种病原体的感染;某种病原体的感染;完整检出策略完整检出策略,即不仅对病原体做出诊,即不仅对病原体做出诊断,还要进行分
5、型(包括亚型)和耐断,还要进行分型(包括亚型)和耐药性方面的检测。药性方面的检测。1.1.一般性检出策略和方法一般性检出策略和方法 针对针对特异性的核酸序列特异性的核酸序列进行核酸分子进行核酸分子探针杂交,或者利用探针杂交,或者利用常规常规PCRPCR技术直接技术直接检出微生物的检出微生物的DNA/RNADNA/RNA,它能够判断,它能够判断有有无感染无感染和是和是何种病原体感染何种病原体感染。2.2.完整检出策略和方法完整检出策略和方法 按照诊断按照诊断分型分型亚型亚型耐耐药性检测的思路药性检测的思路,利用多种分子诊断手,利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行分析。段对感染性病原体进行分析。
6、基因芯片基因芯片、基因测序基因测序等等 二、感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大,可分为杂交法和扩增法。信号放大技术检测方法 靶分子数目不变,而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。靶分子扩增技术检测方法 靶分子(RNA、DNA或探针)的扩增 PCR、替代扩增、LCR等分支链DNA信号放大技术(bDNA)nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)Figure 1.Target generation scheme for SDA.This figure depicts t
7、he initial stepsin an SDA reaction which transform the original target sequence into theamplification cycle depicted in Figure 2.Figure 2.The SDA reaction cycle.These reaction steps continuously cycle during the course of amplification.NoImage引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RN
8、AseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA扩增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 5端带有T7RNA聚合酶结合位点,3端碱基与靶RNA 3端序列互补;的碱基序列与cDNA 3端序列互补三、感染性疾病分子诊断的标本处理 标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子2.阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染3.定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内
9、,在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内,没有临床症状。4.疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群 五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。耐用性的检测 细菌的分型 流行病调查第二节第二节 病毒的基因检测病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起,如病毒性肝人类许多感染疾病由病毒引起,如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等,占人类传染疾炎、脑炎、流行性感冒等等,占人类传染疾病的病的75%75%左右。左右。400400多种不同病毒。多种不同病毒。病毒
10、结构:大病毒结构:大 小:小:20-300nm 20-300nm 核心区:核酸(核心区:核酸(DNADNA或或RNARNA)外周衣壳:蛋白质外周衣壳:蛋白质 包膜:脂质(镶嵌有蛋白质)包膜:脂质(镶嵌有蛋白质)我国是我国是HBVHBV高流行区,高流行区,50%50%70%70%的人受的人受过感染,过感染,8%8%10%10%是是HBVHBV携带者,肝炎患者携带者,肝炎患者中中60%60%是慢性肝炎患者,导致肝硬变,是慢性肝炎患者,导致肝硬变,HBVHBV又与原发性肝癌密切相关。又与原发性肝癌密切相关。外壳(外壳(HBsAg):HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原外壳蛋白成分为表面抗原 核心(核
11、心(HBcAg)HBcAg):DNA DNA DNA DNA 聚合酶聚合酶 HBcAg HBcAg一、一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DaneDane颗粒(完整的病毒)形态颗粒(完整的病毒)形态HBsAgHBcAgHBV DNADNAPol(外膜蛋白)(外膜蛋白)(核衣壳蛋白)(核衣壳蛋白)完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的,核心直径为27纳米,内含DNA双链和DNA多聚酶(一)病毒基因组结构(一)病毒基因组结构 3.2kb3.2kb双链双链DNADNA病毒病毒 不完全双连环状不完全双连环状DNADNA 长链长链L L为负链:有为负链:有4 4个开放阅读框个开放阅读框S S、
12、C C、P P、X X S S区编码外膜蛋白(区编码外膜蛋白(HBsAgHBsAg)C C区编码区编码HBeAg HBeAg、HBcAg HBcAg p p区编码区编码DNADNA聚合酶聚合酶 X X区位编码区位编码X X蛋白,可能与病毒蛋白表蛋白,可能与病毒蛋白表 达有关。达有关。短链短链S S为正链:长短不一为正链:长短不一pre-s1 pre-s1 pre-s2pre-s2S S P P C C pre-cpre-c X XHBV DNA 3.2 kbHBV DNA 3.2 kbpre-S1pre-S1 pre-S1pre-S1蛋白蛋白 pre-S2pre-S2 pre-S2pre-S2
13、蛋白蛋白 S S HBsAgHBsAg pre-Cpre-C HBeAgHBeAg C C HBcAg HBcAg P P DNAP DNAP X X HBxAgHBxAgHBVHBV基因组结构基因组结构(二)分子诊断(二)分子诊断 常用的免疫学检测方法,即二对半的检测存常用的免疫学检测方法,即二对半的检测存在窗口期,不易早期诊断。在窗口期,不易早期诊断。1.PCR 1.PCR 采用普通采用普通PCRPCR、FQ-PCRFQ-PCR、竞争性、竞争性PCRPCR、免疫、免疫杂交杂交PCRPCR,可提供直接、准确的病原学诊断证,可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据据。引物是根据S S、C
14、C、P P、X X基因中高度保守基因中高度保守序列设计,决定扩增的特异性和敏感度。序列设计,决定扩增的特异性和敏感度。扩增位置扩增位置 引物序列引物序列 扩增片断(扩增片断(bp)bp)P P、X X基因基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C C基因基因 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAG
15、CCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C C基因基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 有时为了证实扩增产物的特异性,对扩增有时为了证实扩增产物的特异性,对扩增产物进行以下分析:产物进行以下分析:RLFP RLFP 斑点杂交斑点杂交 Southe
16、rn Southern杂交杂交 2.2.支链支链DNADNA信号放大技术信号放大技术(bDNA(bDNA)原理原理:捕获探针捕获探针 检测检测 靶探针靶探针1 1 体系体系 靶探针靶探针2 2 bDNA bDNA分子分子:DNA:DNA主链上结主链上结 合多个侧链合多个侧链 捕获探针固化在微孔板上捕获探针固化在微孔板上 靶探针靶探针1 1分别与捕获探针及待测核酸杂交分别与捕获探针及待测核酸杂交 靶探针靶探针2 2分别与待测核酸及分别与待测核酸及bDNAbDNA杂交杂交 形成复合物:形成复合物:固相支固相支持物持物捕获捕获探针探针靶探靶探针针1 1CEsCEs待测待测核酸核酸靶探靶探针针2 2L
17、EsLEsbDNAbDNA复复合物合物分支链DNA信号放大技术(bDNA)信号检测:信号检测:bDNAbDNA可结合很多酶标探针,酶催可结合很多酶标探针,酶催化底物(化底物(1,2-1,2-二恶二酮,二恶二酮,dioxetanedioxetane)发光,)发光,使核酸信号放大,且发光强度与使核酸信号放大,且发光强度与DNADNA量成正比。量成正比。优点:放大倍数确定优点:放大倍数确定 阳性检出率高阳性检出率高 稳定性和可重复性好稳定性和可重复性好 操作简便,省时,易于普及操作简便,省时,易于普及支链支链DNADNA技术技术3.3.基因芯片技术基因芯片技术 标本经标本经PCRPCR扩增后与芯片上
18、的特异探扩增后与芯片上的特异探针进行杂交,可以检测:针进行杂交,可以检测:是否有病毒感染是否有病毒感染 感染病毒的种类及亚型感染病毒的种类及亚型 病毒的耐药情况病毒的耐药情况 特点:可同时进行大量标本的检测特点:可同时进行大量标本的检测近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。lamivudineadefovirentecavirtelbivudine(三)临床意义(三)临床意义1.1.早期诊断早期诊断 免疫学检测敏感性:免疫学检测敏感性:0.1 0.1g/ml g/ml 核酸杂交检测敏感性:核酸杂交检测敏感性:0.1p
19、g/ml 0.1pg/ml PCR PCR检测:检测:0.1fg/ml 0.1fg/ml 因此,在感染早期即可通过因此,在感染早期即可通过DNADNA检测证实检测证实病毒的存在。病毒的存在。2.2.监测治疗效果监测治疗效果:HBVDNA10 HBVDNA107 7拷贝拷贝/ml/ml提示病毒复制活跃;提示病毒复制活跃;HBVDNA HBVDNA10104 4拷贝拷贝/ml/ml治疗有一定疗效;治疗有一定疗效;HBVDNA HBVDNA10103 3拷贝拷贝/ml/ml、HBeAgHBeAg阴转、转氨酶阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标;正常为乙型肝炎临床治愈指标;3.3.判断病情,指导制定
20、合理的治疗方案判断病情,指导制定合理的治疗方案4.4.病毒耐药性的检测病毒耐药性的检测 乙肝病毒乙肝病毒DNADNA聚合酶聚合酶YMDDYMDD处的突变是病毒处的突变是病毒产生耐药性的重要原因,通过监测产生耐药性的重要原因,通过监测YMDDYMDD的突的突变情况,可以获得病毒耐药性方面的信息,变情况,可以获得病毒耐药性方面的信息,指导抗病毒治疗。指导抗病毒治疗。二、流行性感冒病毒二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒流行性感冒病毒(Influenza virus)(Influenza virus),是引,是引起流行性感冒的病原体起流行性感冒的病原体;分为甲分为甲(A)(A)、乙、乙(B)(B)和丙
21、和丙(C)3(C)3个个型别型别;根据病毒颗粒表面根据病毒颗粒表面(Haemagglutinin ,HAHA)和和(Neuramiridase,NANA)的抗的抗原性,甲型流感病毒又可分为不同的原性,甲型流感病毒又可分为不同的亚型亚型。甲型流感病毒易发生变异,致病力强,甲型流感病毒易发生变异,致病力强,19181918年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人,年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人,即是由甲型流感病毒引起。即是由甲型流感病毒引起。There are 16 different H antigens(H1 to H16)and nine different N antigens(N1
22、 to N9).(一)流感病毒基因组结构(一)流感病毒基因组结构 单链单链RNARNA病毒,病毒,RNARNA为负链;为负链;有有8 8个个RNARNA片段或片段或7 7个个RNARNA片段;片段;所有所有RNARNA片段片段55末端和末端和33末端高度保守;末端高度保守;两种不同亚型病毒感染宿主时,会生成基因两种不同亚型病毒感染宿主时,会生成基因重配的新病毒;重配的新病毒;RNARNA基因在复制过程中基因在复制过程中 常会发生点突变。常会发生点突变。(二)分子诊断方法(二)分子诊断方法 可采用可采用RT-PCRRT-PCR、FQ-PCRFQ-PCR检测流感病毒检测流感病毒RNARNA。引。引
23、物常按流感病毒保守的非结构基因(物常按流感病毒保守的非结构基因(NSNS)的)的序列进行设计。序列进行设计。为证实为证实PCRPCR扩增产物的特异性或提高检测的灵扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度,可用限制性内切酶分析法、斑点杂交敏度,可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、法、SouthernSouthern印迹法进行扩增产物的分析。印迹法进行扩增产物的分析。扩增位置扩增位置 引物序列引物序列 扩扩增片段大小增片段大小 NSNS基因基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190(bp)(bp)5-CCCATTCTCATTA
24、CTGCTTC-3 5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NSNS基因基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241(bp)(bp)5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3 5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3(三)临床意义(三)临床意义 流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验,这些方法比较培养和血清学血凝抑制试验,这些方法比较费时,灵敏度低,难以作出早期诊断。费时,灵敏度低,难以作出早期诊断。PCRPCR法敏感、特异、简便、快速,并且
25、法敏感、特异、简便、快速,并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。可用于流感病毒的分型和流行病学调查。HIV,human immunodeficiency virus AIDS,acquired immunodeficiency syndrome HIVHIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有的病毒有HIV-1HIV-1、HIV-2HIV-2、HIV-3HIV-3三种。三种。19981998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3.3403.340万,已死亡万,已死亡1.3901.390万,是全球十大主要万,是全球十大
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