第十三章生化药物制造工艺酶类药物课件.ppt

1、第十三章生化药物制造第十三章生化药物制造工艺酶类药物工艺酶类药物2022-10-1第十三章生化药物制造工艺酶类药物（3）从原料来源是否丰富考虑）从原料来源是否丰富考虑；（4）从简化提纯步骤着手。）从简化提纯步骤着手。（5）如用动物组织动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即宰杀后应立即取材取材。从动物或植物动物或植物中提取酶受到原料的限制原料的限制。用微生物发酵法微生物发酵法生产药用酶药用酶，不受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规模生产。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（二）微生物酶制剂高产菌株的选育（二）微生物酶制剂高产菌株的选育 菌种是工业发酵生产酶制剂生产酶制剂的重要

2、条件。目前，优良菌种优良菌种的获得有三条途径三条途径：是从自然界分离筛选分离筛选；是用物理或化学方法物理或化学方法处理、诱变诱变；是用基因重组与细胞融合技术基因重组与细胞融合技术。微生物的分离筛选分离筛选是一切工作的基础。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（三）微生物酶制剂生产的发酵技术（三）微生物酶制剂生产的发酵技术 有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件，要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条最适培养条件件。首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、合理选择培养方法、培养基、培养温度、pH和通气量和通气量等。在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件，如培养基的灭菌方式、种子培养条件

3、、发酵罐的型式、灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制调节控制等。还要研究酶的分离提纯技术分离提纯技术和制备工艺，这些条件的综合结果综合结果将决定酶生产酶生产本身的经济效益。第十三章生化药物制造工艺酶类药物二、酶类药物的提取和纯化二、酶类药物的提取和纯化（一）生物材料的预处理（一）生物材料的预处理 一般应避免剧烈处理避免剧烈处理，但如是结合酶结合酶，则必须进行剧烈处理剧烈处理。1、动物材料的预处理、动物材料的预处理（1）机械处理）机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎细胞并不破碎，而有的酶必须必须细胞破碎细胞破碎后才能有效地提取，

4、因此须采用特殊的匀浆特殊的匀浆才行。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器玻璃匀浆器和组织捣碎器。工业上可用高压匀浆泵高压匀浆泵。（2）反复冻融）反复冻融 由于细胞中冰晶的形成冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的盐浓度的增高增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些使某些酶释放酶释放出来。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（3）丙酮粉）丙酮粉 组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减减少酶的变性少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎细胞结构成分的破碎使蛋白质与蛋白质与脂质脂质结合的某些化学键打开某些化学键打开，促使某

5、些结合酶释放结合酶释放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉丙酮粉。丙酮粉在低温下低温下可保存数年。保存数年。2、微生物的预处理、微生物的预处理 要是酶是胞外酶胞外酶，则可除去菌体除去菌体后后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶胞内酶则需将菌体细胞破壁将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液无细胞的悬液后再行提取。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（1）干燥法）干燥法 干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷空气干燥、真空干燥和冷冻干燥冻干燥三种。（2）机械法）机械法 常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法高压匀浆法等。（3）酶法处理）酶法处理 用得最多的是溶菌酶溶

6、菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处脱氧核糖核酸酶处理理，操作与溶菌酶同。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（二）酶的提取（二）酶的提取 一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详调查研究，文献检索，详细了解欲提取酶的性质细了解欲提取酶的性质。提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活水溶液法，有机溶剂法和表面活性剂性剂法三种。第十三章生化药物制造工艺酶类药物1、水溶液法、水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取稀盐溶液或缓冲液提取。为了防止提取过程中酶活力降低，一般在低温下操作低温下操作。第十三章生化药物制造工艺酶类药物2、有机溶剂法、有机溶剂法 某些结合酶结合酶如微粒体和线粒体膜的酶微粒体和线粒体膜的酶，

7、由于和脂质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合除去结合的脂质的脂质，且不能使酶变性酶变性。最常用的有机溶剂是丁醇丁醇。丁醇具有下述性能：丁醇具有下述性能：亲脂性强亲脂性强，特别是亲磷脂的能力；兼具亲水性兼具亲水性，在0在水中的溶解度为10.5；在脂与水分子间脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用类似去垢剂的桥梁作用。第十三章生化药物制造工艺酶类药物3、表面活性剂法、表面活性剂法 表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性亲水性的或疏水性的原子基团。表面活性剂能与蛋白质结合表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故可用于提取结合酶提取结合酶，但此法用得较少。（三）酶制剂的工业提取法（三）酶制剂的工

8、业提取法 工业生产的酶有二种剂型二种剂型液体制剂和粉剂液体制剂和粉剂1、发酵液的预处理及过滤、发酵液的预处理及过滤 现在处理方法处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂絮凝剂或凝固剂。微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。第十三章生化药物制造工艺酶类药物2、酶液的脱色、酶液的脱色 工业上廉价的脱色剂是活性炭活性炭，用量通常为0115。目前工业上大规模使用脱色树脂脱色树脂国内生产的几种脱色树脂脱色树脂，效果都较好。3、盐析法、盐析法 盐析法的优点优点是在常温下常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用分级沉淀应用得当

9、，杂蛋白杂质也较少，适用于多种多种酶沉淀酶沉淀。第十三章生化药物制造工艺酶类药物4、有机溶剂法、有机溶剂法 用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法分级沉淀法纯化蛋白质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂乙醇作为沉淀剂。5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂 喷雾干燥喷雾干燥有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难过温度这一关温度这一关。喷雾干燥喷雾干燥用于菌体干燥菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥药用酶常用冷冻干燥。除上述方法外，工业上提取酶制剂提取酶制剂的方法还有丹丹宁沉淀法宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀或加热沉淀法、蛋白质表面变性法法、蛋白质表面变性法

10、等。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（四）酶的纯化（四）酶的纯化 酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活，酶比活，二是总活力回收二是总活力回收。本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些技术难技术难点。点。1、杂质的除去、杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、杂蛋白、多糖、脂类和核酸多糖、脂类和核酸等。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（1）pH和加热沉淀法和加热沉淀法 利用蛋白质酸碱变性性质蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调调pH和和等电点等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳定的差异，使杂蛋白变性杂蛋白变性而沉淀。（2）蛋白质表面变性法）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面

11、变性性质的差别，也可除去杂蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去除去杂蛋白杂蛋白。（3）选择性变性法）选择性变性法 利用蛋白质稳定性蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用25三氯乙酸三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都变性杂蛋白都变性而沉淀。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（4）核酸沉淀剂法）核酸沉淀剂法 在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此，可用核酸酶核酸酶，将核酸降解成核苷酸核酸降解成核苷酸。也可用一些核酸沉淀剂核酸沉淀剂如二甲基十六烷基溴化铵二甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等：（5）将酶与

12、底物结合）将酶与底物结合，酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后结合后，稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白加热法除去杂蛋白。第十三章生化药物制造工艺酶类药物2、脱盐和浓缩、脱盐和浓缩（1）脱盐）脱盐 酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤透析和凝胶过滤。（2）浓缩）浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。第十三章生化药物制造工艺酶类药物3、酶的结晶、酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达纯度应达50以以上上），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，酶的纯度酶的纯度经常有

13、一定程度的提高提高。酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段提纯的手段，此外，为研究蛋白质空间结构提供提供射线衍射样品射线衍射样品，也是酶的结晶的重要目标重要目标之一。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（1）酶的结晶方法）酶的结晶方法 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态略处于过饱和状态。改变酶溶解度改变酶溶解度的方法很多，一般新样品新样品往往要使用几种方法几种方法才能得到结晶。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 盐析法。盐析法。在适当的pH、温度温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸

14、钠、硫酸镁和甲酸钠硫酸镁和甲酸钠等。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 有机溶剂法有机溶剂法。酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。结晶用的有机溶剂有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二恶烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷异丙醇、二恶烷、二甲亚砜、二氧杂环己烷等。用有机溶剂法易引起酶失活易引起酶失活。复合结晶法复合结晶法。有时可以利用某些酶某些酶与有机化合物或金属离子有机化合物或金属离子形成复合物或盐复合物或盐的性质来结晶。透析平衡法。透析平衡法。对一定的盐溶液或有机溶剂盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，这时酶液可缓慢地达到过饱和缓慢地达到过饱和而析出结晶。第十三章生化药物制造工

15、艺酶类药物 等电点法。等电点法。一般地说，在等电点附近酶的溶解度很小等电点附近酶的溶解度很小，这一特征为酶的结晶条件结晶条件提供了理论根据。（2）结晶条件的选择）结晶条件的选择 在进行酶的结晶酶的结晶时，要选择一定条件与相应的结晶条件与相应的结晶方法方法配合。这不仅为了能够得到结晶，也是为了保证不引起酶活力丧失酶活力丧失。影响酶结晶因素很多，下列几个条件尤为重要：第十三章生化药物制造工艺酶类药物 酶的纯度酶的纯度。总的来说酶的纯度越高，结晶越容易纯度越高，结晶越容易，长成大的大的单晶单晶可能性也越大。酶的浓度酶的浓度。结晶母液通常应保持尽可能高的浓度保持尽可能高的浓度。酶的浓度浓度越高越高越有

16、利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合，形形成结晶的机会也越大成结晶的机会也越大，对大多数酶来说，蛋白质浓度为510mgml为好。温度温度。结晶的温度通常在4下或室温下或室温25下下，低温条件下酶不仅溶解度低溶解度低，而且不易变性不易变性。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 时间时间。结晶形成的时间长短不一，从数小时到几个月数小时到几个月都有，有的甚至需要1年或更长时间年或更长时间。pH。除沉淀剂的浓度外，在结晶条件方面最重最重要的因素是要的因素是pH。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近等电点附近。金属离子金属离子。许多金属离子金属离子能引起或有助于酶的结酶的结晶，晶，在二价金属离子二价金属

17、离子存在情况下，有促进结晶长大作促进结晶长大作用用。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 晶种晶种。不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶。生长大的单晶时，也可引入晶种。结晶器皿处理结晶器皿处理。结晶用的器皿要充分清洗、烘充分清洗、烘干干。使用前用结晶母液再冲洗一次结晶母液再冲洗一次，也可用压缩空气压缩空气或惰性气体吹去灰尘或惰性气体吹去灰尘。用于长结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目减少晶核数目，有助于形成大的单晶。第十三章生化药物制造工艺酶类药物4、酶分离和纯化工作中的注意事项、酶分离和纯化工作中的注意事

18、项 酶是蛋白质，一般不太稳定不太稳定。提纯过程中，酶纯酶纯度越高，就越不稳定度越高，就越不稳定，酶分离纯化时尤其要注意以下注意以下几点：几点：（1）防止酶蛋白变性）防止酶蛋白变性 为防止酶蛋白变性，应避免pH过高或过低过高或过低，应避免高温。避免高温。一般要在中性中性pH和低和低温（温（4左右）下操作左右）下操作。为防止酶蛋白的表面变性表面变性，不可剧烈搅拌不可剧烈搅拌，以免产生泡沫产生泡沫。应避免酶和重金属酶和重金属或其他蛋白变性剂接触。如要用有机溶剂处理酶液，操作尽可能在低温下，短时间内低温下，短时间内进行。（2）防止辅因子的流失）防止辅因子的流失 有些酶除酶蛋白外，还含有辅酶、辅基和金属

19、等辅因子辅酶、辅基和金属等辅因子。在进行超滤、透析超滤、透析等操作时，要防止这些辅因子的流失防止这些辅因子的流失。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（3）防止酶被蛋白水解酶降解）防止酶被蛋白水解酶降解 在提取液尤其微生物培养液中，常常同时存在一些蛋白水解酶蛋白水解酶，要及时采取有效措施将它们除去。如果操作时间长，还要防止杂菌污染酶液防止杂菌污染酶液，造成所需要酶的失活酶的失活。第十三章生化药物制造工艺酶类药物三、重要酶类药物的制备三、重要酶类药物的制备（一）药用酶类的概述（一）药用酶类的概述 现在国内外已广泛应用于多种疾病的治疗，其制剂品种制剂品种已超过700余种余种。1、与治疗胃肠道疾病有关的

20、酶类药物、与治疗胃肠道疾病有关的酶类药物 利用酶作为消化促进剂消化促进剂，早已为人们所采用。2、消炎酶类、消炎酶类3、与纤维蛋白溶解作用有关的酶类与纤维蛋白溶解作用有关的酶类4、抗肿瘤的酶、抗肿瘤的酶5、其它药用酶、其它药用酶第十三章生化药物制造工艺酶类药物1、胃蛋白酶、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）胃蛋白酶胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取胃粘膜中提取。（1）组成（结构）、性质）组成（结构）、性质 药用胃蛋白酶胃蛋白酶是胃液中多种多种蛋白水解酶蛋白水解酶的混合物混合物，含有胃蛋白酶胃蛋白酶、组织蛋白酶组织蛋白酶、胶

21、原酶胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性酸性，难溶于乙醇、氯仿乙醇、氯仿等有机溶剂。pI为为pH1.0，最适最适pH1.52.0。可溶于可溶于70乙醇和乙醇和pH4的的20乙醇中。乙醇中。胃蛋白酶胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质水解大多数天然蛋白质底物。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（2）生产工艺）生产工艺 1）工艺路线：）工艺路线：胃蛋白酶原胃蛋白酶原盐酸盐酸催化催化激活激活成胃蛋白酶胃蛋白酶。常用的脱脂剂脱脂剂有乙醚乙醚、氯仿氯仿、四氯化碳四氯化碳。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 2）工艺过程：）工艺过程：3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：向经消化消化、提取提取、

22、脱脂脱脂、分层分层、浓缩浓缩及60丙酮沉淀丙酮沉淀分离分离胃膜素胃膜素的母液母液中中，边搅拌边加冷丙酮冷丙酮，至比重为比重为0.91，即有淡黄色淡黄色胃蛋白酶胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶胃蛋白酶。4）结晶胃蛋白酶的制备）结晶胃蛋白酶的制备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20酒精酒精中，加H2SO4调pH3.0，5静置20h后过滤，加硫酸镁硫酸镁至饱和，进行盐析盐析。盐析物再在pH3.84.0的乙醇中的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调硫酸调pH至至1.82.0，即析出针状胃蛋白酶针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇的乙醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至至1.8，在20放置

23、，可得板板状或针状状或针状结晶。第十三章生化药物制造工艺酶类药物2、胰蛋白酶、胰蛋白酶 胰蛋白酶胰蛋白酶是从牛、羊胰脏牛、羊胰脏提取、结晶的冻干制剂。（1）化学组成与性质）化学组成与性质 易溶于水易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时煮沸短时煮沸几乎不失活；在碱溶液碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用有保护和激活作用，胰蛋白酶的pI为为10.1。牛胰蛋白酶在肠激酶肠激酶或自身催化或自身催化下，释放出6肽肽，变成有活性的胰蛋白酶有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组

24、成的肽键酸羧基所组成的肽键。酶本身很酶本身很容易自溶容易自溶。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（2）生产工艺）生产工艺 1）工艺路线：）工艺路线：第十三章生化药物制造工艺酶类药物3、尿激酶、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）尿激酶尿激酶，是一种碱性蛋白酶碱性蛋白酶。由肾脏肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中哺乳动物的尿中。（1）组成（结构）性质）组成（结构）性质 1）尿中的尿胃蛋白酶原尿胃蛋白酶原，在酸性条件下酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶尿胃蛋白酶，把天然尿激酶原降解尿激酶原降解成为尿激酶尿激酶。2）尿激酶尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶蛋白水解酶，它作用于精氨酸精氨酸-

25、缬氨酸缬氨酸键使键使纤溶酶原纤溶酶原转为纤溶酶纤溶酶。尿激酶尿激酶也具有酯酶活力酯酶活力。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 3）尿激酶尿激酶的pI为为pH89，主要部分在pH8.6左右左右。溶液状态不稳定溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年稳定数年。加入1EDTA、人血白蛋白或明胶人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性表面变性作用。（2）生产工艺）生产工艺1）工艺路线：）工艺路线：第十三章生化药物制造工艺酶类药物 2）工艺过程：）工艺过程：硅藻土吸附，0.02氨水加0.1molL氯化钠洗洗脱脱。QAESephadex层析柱 去热原、色素热原、色素。CMC浓缩浓缩。第十三章生化药物制造工艺酶类药物4、

26、蚯蚓纤溶酶、蚯蚓纤溶酶 本草纲目本草纲目中记载蚯蚓又称地龙、曲蟮地龙、曲蟮，能活血化淤，主治肢体麻木，口眼歪斜语言障碍，半身不遂等。近代生物学家发现，蚯蚓死后，其死体能很快的自行溶解。经研究揭示，蚯蚓体内存在有纤维蛋白水纤维蛋白水解酶及纤维蛋白酶原激活物质解酶及纤维蛋白酶原激活物质而使其死体自行溶解自行溶解。人们以人工养殖的蚯蚓为原料，获得一组能水解纤维水解纤维蛋白的活性物质蛋白的活性物质，称为蚯蚓纤溶酶蚯蚓纤溶酶。经药理实验证明，对体内、体外血栓和纤维蛋白血栓和纤维蛋白均有明显的溶解作用，能使纤维蛋白的精氨酸及赖氨酸羧基端链水解精氨酸及赖氨酸羧基端链水解，又能又能激活纤溶酶原转化成纤溶酶激活

27、纤溶酶原转化成纤溶酶，具有双重作用，溶栓更迅速，更彻底。第十三章生化药物制造工艺酶类药物（1）化学组成和性质）化学组成和性质 蚯蚓纤溶酶蚯蚓纤溶酶是一组蛋白水解酶类。蚯蚓的种类不同，其含酶量和酶的活性酶量和酶的活性也不同活性组分的相对分子相对分子量通常在量通常在2000070000。呈白色或微黄色白色或微黄色粉末，易溶于水，最适最适pH8，加热，加热70全部失去活力。制备时，常选用赤子爱胜蚓、锯齿远蚓、太平赤子爱胜蚓、锯齿远蚓、太平2号号蚓蚓（赤子爱胜蚓与美国红蚯蚓杂交种）、湖北环毛蚓湖北环毛蚓）等。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 2）以赤子爱胜蚓为原料制备蚯蚓纤溶酶蚯蚓纤溶酶 取人工养殖蚯

28、蚓放入水中浸泡浸泡1h，尽量排出内脏污物，洗净，于组织捣碎机中匀浆匀浆，再加入等体积01molL NaCl液液，于冰箱中提取6h，以6000rmin离心离心20min，弃取沉淀，上清液加固体（NH4）2SO4至至70饱和度饱和度，冰箱放置过夜，次日过滤，收集沉淀，透析透析去盐，以8000rmin离心离心30min，上清液冷冻干燥，得蚯蚓纤溶酶粗品。将粗品粗品经Sephadex G 175柱凝胶过滤柱凝胶过滤，分出3个组分，纤溶活性几种在B峰。将B峰合并，透析，冷冻干燥。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 取B峰40mg在DEAE Sephadex CL 6B柱上层析分离，层析柱以002molL，

29、pH 78磷酸盐缓冲液平衡，样品上柱，用用NaCl溶液进行梯度洗脱溶液进行梯度洗脱，其中峰B至峰至峰B 有纤溶活性。第十三章生化药物制造工艺酶类药物5、溶菌酶、溶菌酶（Lysozyme）溶菌酶溶菌酶，又称胞壁质酶胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解乙酰胞壁质聚糖水解酶酶。它广泛存在于鸟类和家禽鸟类和家禽的蛋清蛋清、哺乳动物的泪、泪、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）细胞内细胞内，其中以蛋清含量最丰富蛋清含量最丰富。溶菌酶溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质杀菌作用的天然抗感染物质，具有抗菌、抗病毒、抗炎症抗菌、抗病毒、抗炎症。（1）组成（结构）和性质）组成（结构）和性质 溶菌酶溶菌酶是一碱性球蛋白碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸碱性氨基酸、酰酰氨残基氨残基及芳香族氨基酸芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。第十三章生化药物制造工艺酶类药物 溶菌酶溶菌酶能催化粘多糖或甲壳素粘多糖或甲壳素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键糖苷键。溶菌酶溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质稳定蛋白质。在pH5.5 加热加热4h后，酶变得更活泼。低浓度的低浓度的Mn（10-7molL）在中性和碱性条件中性和碱性条件下下能使酶免受热的失活作用免受热的失活作用。第十三章生化药物制造工艺酶类药物2022-10-1第十三章生化药物制造工艺酶类药物