感染性疾病的分子生物学检验课件.ppt

1、q 感染是病原体和人体之间的相互作用过程感染是病原体和人体之间的相互作用过程q 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫q 病原微生物：致病菌（条件致病菌）病原微生物：致病菌（条件致病菌）微生物人体微生物人体不不同同的的感感染染状状态态共共生生状状态态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生 q病原体被清除病原体被清除 -通过非特异性或特异性免疫通过非特异性或特异性免疫q隐性感染隐性感染 -是感染过程中最常见的类型是感染过程中最常见的类型q显性感染（临床感染）显性感染（临

2、床感染）-感染致病，慢性感染引起炎症感染致病，慢性感染引起炎症q潜伏性感染潜伏性感染q潜伏感染期间，病原体一般不排出体外潜伏感染期间，病原体一般不排出体外q病原携带状态病原携带状态 -可以没有临床症状，而能排出病原体可以没有临床症状，而能排出病原体q带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者q不同携带状态不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性携带者携带者q是很多传染病的重要传染源是很多传染病的重要传染源q一般性检出策略（检出病原体）：q判断有无感染q是何种病原体感染q常用方法：PCR 杂交q完整性检出

3、策略：q检出病原体q分型（分类）亚型耐药性q常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序q病原体核酸分子（DNA/RNA）q基因表达产物q代谢物q免疫应答分子细细胞胞免免疫疫体体液液免免疫疫TT致敏致敏T细胞细胞淋巴因子淋巴因子B浆细胞浆细胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出现感染早期出现临近恢复期出现临近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关与原虫和蠕虫感染有关q定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断q动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据病毒病毒核衣壳核衣壳（nucleocapsid）包膜（包膜（envelope）刺突（刺突（spike

4、）核酸（核酸（nucleic acid）DNA or RNA衣壳（衣壳（capsid）衣壳粒衣壳粒核酸核酸蛋白质衣壳蛋白质衣壳q全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区q每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因q中国：50%70%的人受过感染，8%12%是HBV携带者 世界其它地区世界其它地区A(n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜包膜负负链链DNA包包裹裹后后的的前前基基因因 mRNA传染性传染性HBV病毒颗粒病毒颗粒传染性传染性HBV病毒颗粒病毒颗粒部分双链部分双链DNA逆转录酶逆转录酶DNA聚合酶聚合酶HBV基qHBV DNA是带有部分单链区的环状双链DNA分子，是目

5、前已知感染人类最小的DNA病毒。q基因组长为3.2kbq长链称为负链用“L(-)”表示，长度是固定的，它携带有病毒全部的编码信息；q短链称为正链用“S(+)”表示，S(+)在不同的分子中长度不等，大约是负链的50%100%。q粘性末端qDR区域是DNA成环及病毒复制的关键区域qHBV基因组负链DNA核苷酸序列上含有6个开放读码框架：S、C、P、X、前-前-S和前-Xpre-S1 pre-S1 pre-S1蛋白蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白蛋白 S HBsAg（S蛋白）蛋白）pre-C+C HBeAg C HBcAg（C蛋白）蛋白）P DNAP（P蛋白）蛋白）X HBxAg（X蛋白）蛋白）

6、编码编码HBsAgpre-S2基因重叠基因重叠HBV 检测窗口期检测窗口期血清学（血清学（HBsAg）：）：56天天PCR：33天天缩短缩短23天（平均天（平均6-15天）天）q普通PCR技术q荧光定量PCR技术q支链DNA技术（核酸探针杂交标记信号放大技术。支链DNA（bDNA）是人工合成的带有许多侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标志物。检测时，其靶核酸本身不被扩增）q核酸杂交技术 q杂交捕获系统 q基因芯片技术HBV DNA检测（检测（PCR）PCR 引物是引物是PCR扩增的关键，决定扩扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。增的特异性和敏感度。PCR引物常根据引物常根据其

7、其S、C、P和和X基因中的基因中的高度保守序列高度保守序列来设计。来设计。部分常用的引物序列部分常用的引物序列q进行HBV DNA检测的同时使其进行相对的量化q更直接了解乙肝患者体内HBV的复制及传染性，能准确地反映出HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。q其特异性高，灵敏度可达0.01fg，检测范围为2.51022.5109copies/ml。乙型肝炎病毒q最常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦（adefovir）q耐药性：qHBV的高变异性（逆转录酶缺乏严格的校正功能）q人体免疫应答或疫苗接种等压力q拉米夫定-与dNTP竞争HBV

8、 DNAP（逆转录酶区）从而抑制复制起到治疗作用。q当HBV DNAP氨基酸序列发生改变使HBV DNAP与拉米夫定的结合能力明显下降，产生了对拉米夫定的耐药性。q1.基因测序法q2.荧光定量PCR方法q基本原理q确定探针特定的TM值来区分是否突变q常用方法q覆盖突变位点荧光双探针杂交 YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74qHBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：qA型主要存在于白人，qB型和C型主要存在于亚洲人群qE型主要存在于西非qF型仅见于中南美洲的土著人qG型和H型很少见q不同基因型序列

9、长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型 qPCR-RFLP qPCR-RDBqELISAq基因芯片技术HBV的分子生物学检验的临床应用q早期诊断q监测治疗效果（病毒拷贝数）q判断病情q耐药检测q急性丙肝的临床诊断q1.流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。q2.临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。q3.实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA阳性。q约

10、90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 q血中HCV含量仅为HBV的千分之一qHCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难qHCV的变异性很高，使其诊断十分困难qHCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体q呈球形颗粒q直径约50nmq有一脂质包膜q核心：单股正链RNA，全长9.5 kbq仅一个开放读框（ORF），编码一条含有3010 3033个氨基酸的病毒前体多肽 q由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性qHCV分为6个（IVI）主要基因型（Simmonds

11、），各型又由若干亚型（a、b、c）组成qHCV RNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案HCV分子qHCV RNA定性q定性检测方法：RT-PCRqHCV RNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性即可确证HCV感染q一次检测阴性不能完全排除HCV感染，应重复检查 qHCV RNA定量（病毒载量测定）qbDNAqreal-time RT-PCR（SOP）q1 样本处理（样本处理区）q2 扩增试剂准备（PCR前准备区）q3 加样（样本处理区）q4 RT-PCR反应（检测区）qHCV基因分型常用方法：测序分析法、RFLP、实时荧光PCR、基因型特异性引

12、物扩增法、型特异性核酸探针杂交法及基因分型检测芯片等human immunodeficiency virus（HIV）截至2013年9月30日,全国共报告现存艾滋病病毒感染者约43.4万例Step 1:BindingStep 2:Reverse TranscriptionStep 3:IntegrationStep 4:ReplicationStep 5:TranslationStep 6:Viral Assemblyq基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同q其正链RNA分子大小为 HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因 HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因q5端有帽子结

13、构，3端有poly(A)结构 q第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序（long terminal repeats）gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白 pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白qLTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性q第二组：参与基因表达的调节基因 tat（trans-acting transcriptional gene）rev（regulator of expression of viral protein）nef（negative regula

14、tor factor）q第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U）vpr（viral protein R）q高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，是基因组的保守区域qHIV疫苗研发难度大窗口期：窗口期：检测抗体检测抗体 2-12周周检测检测p24抗原抗原 2-3周周 检测检测RNA 11天天qHIV抗体检测（窗口期测p24抗原，可辅助诊断）q初筛试验：酶联免疫吸附试验（ELISA）q试纸（金标试纸，双抗原夹心法）q最短在感染6天之后就可以检测到 q确

15、认试验：免疫印迹（Western blot,WB）qHIV RNA 定性测定方法：qRT-PCRq基因芯片技术q集合核酸定性检测q原位杂交HIV病毒载量（q主要有三种技术：qRT-PCR（最低检测限为50copies/ml）qbDNA（最低检测限为50copies/ml）qNASBA（最低检测限为20 copies/ml）qNASBA（nucleic acid sequence-based amplification）q基于核酸等温扩增技术qPCR检测前病毒DNA，对出生48h内婴儿的检测敏感性为38%，出生14d婴儿的检测敏感性可为93%人类免疫缺qHIV由于高错误率的逆转录酶、病毒的快速复

16、制、宿主的免疫选择作用、不同毒株DNA之间的基因重组等原因，其基因具有很高的变异性。q目前，HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用方法有：序列分析法、异源双链核酸泳动实验、限制性片段长短多态性分析、DNA酶联免疫技术、基因芯片技术、多重PCR技术等。q耐药是抗病毒药物作用的病毒基因发生突变的结果。qHIV快速产生的耐药是影响治疗效果的主要因素。q已经确定的与6类艾滋病抗病毒药物耐药有关的HIV基因突变有200多个。q耐药性检测方法种类多，主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力。q方法：基因芯片耐药检测、等位基因探针杂交、寡核苷酸链接

17、分析法与直接测序法等。第九章 细菌感染的分子生物学检验q意义：q不易培养的病原菌（营养苛求菌）q难以培养的病原菌（生长缓慢）q鉴定病原菌（分子标志物）qDNAq16S rRNA（属特异性）q23S rRNAq耐药株测定q流行株分型 WHO2009年全球结核病控制报告:q全球有1/3人口即17亿人感染了结核杆菌，每1秒钟就有1人受感染q全球现有肺结核病患者1370万，结核病每年发病人数为927万，每年死亡人数177万q结核病仍为单一病原菌引起疾病死因的第一位q发病人数占前五位的国家分别为印度、中国、印度尼西亚、尼日利亚、南非1882年由年由Robert Koch发现发现 q环状双链DNA，共有4

18、403765bp（4.4Mb），G+C平均值65.6%q共有4033基因q功能已知的有1734个q605个基因编码的蛋白，可见于其他菌种，推测也在TB中存在（交叉）q1694个未知功能q酶：q药物水解酶q药物修饰酶（如：乙酰转移酶，很多药物外排泵系统）q壁：具有高度疏水的细胞壁，充当渗透屏障q分子生物学检验方法是直接以结核杆菌的种属特有基因和耐药相关基因为检测对象q涂片染色镜检（痰涂片法阳性率低，只有20%80%，易受其他抗酸性分枝杆菌的污染）q分枝杆菌分离培养（结核病诊断的“金标准”，但结核杆菌生长缓慢，增殖一代需1018小时，生长成可见菌落一般需46周，不利于临床上的及时诊断和治疗）q分枝

19、杆菌素试验（结核杆菌素试验如果呈阳性，也仅表示结核感染，并不一定代表患病）q血清学试验（分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉，特异性不强）q分枝杆菌药物敏感试验q分子生物学检验（分子生物学检验）q1.TB DNA检测q方法：PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂交法(LPA)、链替代扩增技术(SDA)、扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTDT)、基因芯片技术、测序等方法检测标本中的TB DNAqPCR扩增所选靶序列q65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等q扩增产物用核酸杂交法进一步鉴定产物的特异性结核杆菌基因检

20、测中部分常用的引物结核杆菌基因检测中部分常用的引物 q2.TB 耐药性检测q对利福平（一线药）抗性的检测q靶基因为rpoB基因q90%98%的耐利福平结核杆菌都检测到rpoB突变。rpoB基因全长3 543个碱基。当其中507533位密码子(81bp)的核心区域耐利福平决定区(RRDR)发生突变（点突变或短的插入、缺失突变）时，使DNA依赖性RNA聚合酶亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶亚单位结合而表现为耐药。其中以编码531位氨基酸的碱基TCGTTG和编码526位氨基酸的碱基CACTAC的突变最常见。q2.TB 耐药性检测q对异烟肼（一线药）耐药q靶基因：katG基因、inhA基

21、因等点突变、缺失或插入q主要是katG基因的突变，完全缺失占异烟肼耐药菌株的7%24%，出现于高水平耐异烟肼分离株中，katG随机突变占50%70%，常见的点突变是315位AGCACC和463位CGGCTG。qinhA基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%35%。由于inhA结构基因突变造成异烟肼与NADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的CT的点突变可能创造一个强有力的启动，使inhA蛋白过度表达从而提高对异烟肼活性形式所需的浓度，引起对异烟肼耐药。qDNA 测序qPCR-SSCPqPCR-RFLPqPCR-RDBq基因芯片技术q淋病的病原菌，革兰染色阴性双球菌，1879年首次发现q人是

22、奈瑟菌属的天然宿主（但对人致病的只有淋病奈瑟菌及脑膜炎球菌），淋病菌多侵犯尿道粘膜，主要通过性传播 q淋病的临床表现缺乏特异性，确诊主要依靠实验室检查q淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成测序研究的淋病奈瑟菌菌株之一，它的染色体DNA长度为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。编码区的DNA长度占总长度的78%。共含有2 069个基因，包括2 002个具有编码功能的基因和67个编码结构性 RNAs基因。q淋病奈瑟菌都含有1至数个质粒（内源性质粒）q83%菌株含分子量2.6MDa的质粒（隐蔽性质粒）q2%含有24.5MDa的质粒（介导自身及耐药质粒的转移）q13%同时含有这两种质粒q淋

23、病奈瑟菌与脑膜炎奈瑟菌间具有80%的同源序列（其它细菌同源性较低）q传统的涂片染色法q敏感度低，在女性病人中检出率仅50%左右，也不能确诊q分离培养法q对标本和培养基营养要求高，出结果慢，且阳性检出率受影响因素多，难以满足临床要求q免疫学方法q无论是荧光法还是酶染法，由于分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体方法间的稳定性和条件限制，使推广应用受限q分子生物学检验方法q敏感、特异，可直接从临床标本中检出含量很低的病原菌，适于淋病奈瑟菌的快速检测 NG 分子生q1.PCRq目前常用在所有淋病奈瑟菌中普遍存在的编码外膜蛋白III的结构基因为靶序列q也常用多拷贝的16S rRNA基因、CPPB基因（

24、同时存在于染色体DNA和隐蔽质粒上）作为靶序列（为提高检测的特异性可用巢式PCR）q2.实时荧光定量 PCR 技术q3.连接酶链式反应（ligase chain reaction,LCR）q4.链替代扩增技术SDAq主要由染色体和质粒的基因改变而引起q1.淋病奈瑟菌的主要耐药基因q（1）gyrA和parC基因：gyrA和gyrB基因编码的DNA旋转酶是氟喹诺酮类药物作用的靶位。qgyrA基因突变可导致酶结构的改变，阻止氟喹诺酮类药物进入靶位，引起耐药。gyrA基因突变与淋球菌低水平和中度水平氟喹诺酮类药物耐药有关，而对氟喹诺酮类药物高水平耐药是gyrA和parC共同参与基因突变的结果，gyrA

25、和parC是氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)中的两个重要基因。q（2）penA、ponA基因：青霉素结合蛋白(PBPs)为淋球菌重要的外膜蛋白。编码PBPs的基因主要有penA、ponA基因，如果上述基因中发生突变，就会导致PBPs结构的改变，使PBPs与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产生耐药性。q（3）porB基因q（4）Mtr系统调控基因q（5）erm基因q淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术：DNA 测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术第十章 真菌与其它病原体的分子生物学检验q真核细胞型微生物，具有典型的细胞核，有完整的细胞器q真菌的种类繁多（有150

26、余万种），对人致病的真菌不多，分为四类：q病原性真菌q条件致病性真菌q产毒真菌q致癌真菌q近年来，真菌病的发病率有明显上升趋势，特别是由念珠菌、曲霉菌和隐球菌所致深部真菌感染，这与临床上滥用抗生素、激素及使用免疫抑制剂、抗癌药物导致机体免疫功能下降有关。q病原体培养：临床常规病原体培养检出率低，而且样本易受污染造成假阳性；q病理组织学检查由于组织标本难以获得,尤其是深部真菌感染的组织标本获得不易，因此，在临床应用上有其局限性q血清学检查：主要是检测体液中的抗原，方法方便快速，但不能精确到真菌的种，且某些食物、药物也可影响检测结果，目前没有广泛应用于临床一、白假丝酵母菌的分子生物学检验q健康人群

27、皮肤、黏膜表面共生的微生物，正常人健康人群皮肤、黏膜表面共生的微生物，正常人群带菌率可高达群带菌率可高达40%。它是一种。它是一种重要的条件致病重要的条件致病菌。菌。q在免疫功能缺陷者中可引起反复浅表性黏膜感染在免疫功能缺陷者中可引起反复浅表性黏膜感染或严重系统性感染，最常见的是鹅口疮和酵母菌或严重系统性感染，最常见的是鹅口疮和酵母菌性阴道炎。性阴道炎。白假丝酵母菌的基因组结构特征白假丝酵母菌的基因组结构特征q白假丝酵母菌的致病因素包括粘附因子、生物膜白假丝酵母菌的致病因素包括粘附因子、生物膜、菌丝等，因此编码形成粘附素、生物膜及菌丝、菌丝等，因此编码形成粘附素、生物膜及菌丝体的基因即为体的基

28、因即为致病相关基因致病相关基因。q研究较多的基因是编码粘附素的研究较多的基因是编码粘附素的ALS基因家族和基因家族和编码分泌性天冬氨酸蛋白酶的编码分泌性天冬氨酸蛋白酶的SAP基因家族。基因家族。q耐药基因目前发现白假丝酵母菌耐药基因目前发现白假丝酵母菌耐氟康唑耐氟康唑的基因的基因有有ERG3、ERG11、CDR1、CDR2、MDR1、FLU1、CAP1等等白假丝酵母菌的分子生物学检验白假丝酵母菌的分子生物学检验q主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA、RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等）的检测、基因分型和耐药基因分析等q1.PCR技术：普通技术：普通PCR

29、、实时、实时PCR、巢式、巢式PCR和和多重多重PCRq2.PCR-斑点杂交斑点杂交q3.DNA指纹技术：包括限制性片断长度多态性分指纹技术：包括限制性片断长度多态性分析析(RFLP)、随机扩增多态性分析、随机扩增多态性分析(RAPD)、电泳、电泳核型分析核型分析q4.AP-PCR技术：任意合成的单个寡核苷酸引物技术：任意合成的单个寡核苷酸引物q序列分析序列分析q6.基因芯片技术基因芯片技术白假丝酵母菌的基因组结构特征白假丝酵母菌的基因组结构特征q二倍体生物，其基因组长度约为二倍体生物，其基因组长度约为16Mb(单倍体单倍体)，有八对同源染色体，电泳核型分析大小为有八对同源染色体，电泳核型分析

30、大小为0.52.8Mb 之间。之间。q功能基因不均匀的分布在八对染色体上。功能基因不均匀的分布在八对染色体上。q特点：特点：产生遗传多样性的染色体长度多态性现象产生遗传多样性的染色体长度多态性现象，即酵母菌染色体发生数值和结构性的重排、相，即酵母菌染色体发生数值和结构性的重排、相互易位、缺失和个别染色体的三倍性。突变频率互易位、缺失和个别染色体的三倍性。突变频率高，导致白假丝酵母菌适应环境的显型改变。高，导致白假丝酵母菌适应环境的显型改变。q衣原体细胞内寄生特性，其分离培养较为衣原体细胞内寄生特性，其分离培养较为困难。困难。q衣原体包涵体的形态、细胞内定位、染色衣原体包涵体的形态、细胞内定位、

31、染色性等特征，具有鉴别衣原体的意义，所以性等特征，具有鉴别衣原体的意义，所以，以往主要靠涂片寻找包涵体和血清学试，以往主要靠涂片寻找包涵体和血清学试验等方法检测。验等方法检测。沙眼衣原体的分子生物学检验沙眼衣原体的分子生物学检验q人类是沙眼衣原体的自然宿主。人类是沙眼衣原体的自然宿主。q主要寄生于机体黏膜上皮细胞。主要寄生于机体黏膜上皮细胞。q沙眼衣原体的沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物沙眼衣原体的沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型与人类疾病密切相关，根据其主要外膜蛋白（型与人类疾病密切相关，根据其主要外膜蛋白（MOMP）的抗原部分又分为）的抗原部分又分为18种血清型。种血清型。沙眼衣原体的基因组

32、结构特征沙眼衣原体的基因组结构特征q沙眼衣原体原体和始体内皆含有沙眼衣原体原体和始体内皆含有DNA和和RNA两种两种核酸。核酸。q如：沙眼衣原体血清型如：沙眼衣原体血清型D基因组大小为基因组大小为1.04Mb，G+C含量占含量占41.3%，整个基因组有，整个基因组有894个蛋白编码个蛋白编码的基因的基因q外膜主蛋白基因为染色体基因组的一部分，包括外膜主蛋白基因为染色体基因组的一部分，包括5个保守区和个保守区和4个可变区。个可变区。q沙眼衣原体存在特别强的沙眼衣原体存在特别强的DNA修复和重组系统，修复和重组系统，但衣原体作为一种胞内寄生菌，其基因组和其他但衣原体作为一种胞内寄生菌，其基因组和其

33、他细菌以及宿主细胞间都有细菌以及宿主细胞间都有广泛的遗传交换广泛的遗传交换。沙眼衣原体的分子生物学检验沙眼衣原体的分子生物学检验q主要包括沙眼衣原体特异性核酸（主要包括沙眼衣原体特异性核酸（DNA、RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析。的检测、基因分型和耐药基因分析。q1.PCR技术技术qPCR、实时荧光定量、实时荧光定量 PCR、巢式、巢式PCR、竞争性、竞争性PCRq引物序列多选自下列三种基因：主要外膜蛋白基因、隐引物序列多选自下列三种基因：主要外膜蛋白基因、隐蔽性质粒蔽性质粒DNA和和16S rRNA基因序列基因序列q2.LCR技术技术q3.DNA序列分析序列分析q支原体支原体(myc

34、oplasma)是一类目前所知能独立生活是一类目前所知能独立生活，自行繁殖的，自行繁殖的最小原核细胞微生物最小原核细胞微生物，区别于其他，区别于其他原核生物的显著特点是原核生物的显著特点是没有细胞壁没有细胞壁，因而具有可，因而具有可塑性、可滤过性、易溶解性等生物学特征。塑性、可滤过性、易溶解性等生物学特征。q支原体的大小一般在支原体的大小一般在0.20.3m，内含一个环状，内含一个环状双链双链DNA，形态上呈多形性。，形态上呈多形性。q对对四环素及大环内酯类四环素及大环内酯类等干扰蛋白质合成的抗菌等干扰蛋白质合成的抗菌药物敏感。对宿主、器官和组织具有高度的特殊药物敏感。对宿主、器官和组织具有高

35、度的特殊亲和性亲和性肺炎支原体的分子生物学检验肺炎支原体的分子生物学检验q非典型肺炎的病原体非典型肺炎的病原体q粘附于宿主呼吸道上皮细胞，多在老年人粘附于宿主呼吸道上皮细胞，多在老年人和青少年中引起非典型性肺炎和青少年中引起非典型性肺炎肺炎支原体的基因组结构特征肺炎支原体的基因组结构特征q肺炎支原体肺炎支原体M129株基因组为单一双股环状株基因组为单一双股环状DNA分子分子，全长，全长816 394bp，G+C含量为含量为40%q缺失合成细胞壁和合成氨基酸的基因；缺失合成细胞壁和合成氨基酸的基因；q维生素、核酸前体及脂肪酸合成的基因也非常少维生素、核酸前体及脂肪酸合成的基因也非常少。qMP携带

36、着较多的携带着较多的编码粘附素及变异的表膜抗原基编码粘附素及变异的表膜抗原基因因，从而有利于侵入宿主并逃逸宿主的免疫攻击，从而有利于侵入宿主并逃逸宿主的免疫攻击。肺炎支原体的分子生物学检验肺炎支原体的分子生物学检验q主要包括其特异性核酸（主要包括其特异性核酸（DNA、RNA）的检测、）的检测、基因分型和耐药基因分析。基因分型和耐药基因分析。q1.PCR技术技术 PCR检测检测MP的靶序列常选在的靶序列常选在16S rRNA基因组可变区、保守区、基因组可变区、保守区、P1蛋白基因区。蛋白基因区。q2.核酸杂交核酸杂交q3.PCR-RFLP 采用采用PCR-RFLP方法可以对肺炎支方法可以对肺炎支

37、原体进行分型，还可以采用原体进行分型，还可以采用PCR扩增耐药基因经扩增耐药基因经产物测序或用产物测序或用RFLP进行耐药分析。进行耐药分析。q适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等；q通过检测细菌16SrRNA基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种；q进行病原体感染的早期诊断，确定感染病原体的类型；q通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展；q进行病原体感染的分子流行病学调查；q对病原体进行基因分型；q检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，如血清学检测的“窗

38、口期”问题，具有快速、特异、灵敏度高等优点。q 病毒感染的病毒感染的潜潜伏期伏期（窗窗口口期期）血清中血清中并无并无抗抗体体的存在，的存在，无无法以法以免疫免疫学学的方法的方法来检测来检测q PCR检测检测病毒量的病毒量的变变化上，比化上，比传统传统的方法更快速，有更高的的方法更快速，有更高的特特异性异性及及灵灵敏度敏度 病例分析病例分析q某位患者疑为淋球菌感染，用淋球菌感染，用青霉素治疗炎症有所缓解，但是持续用药2周之后，发现病情反复或有加重的趋势，实验室检查排除其它感染的可能，请用分子生物学检验原理分析可能的原因，如何检测？q解答重点：解答重点：q1.原因分析根据病情分析可能是发生了耐药。

39、根据病情分析可能是发生了耐药。青霉素结合蛋白青霉素结合蛋白(PBPs)为淋球菌重要的外膜蛋白，青霉素主要通过靶为淋球菌重要的外膜蛋白，青霉素主要通过靶向向PBPs作用于淋球菌。作用于淋球菌。编码编码PBPs的基因主要有的基因主要有penA、ponA基因，在较长时间使用青霉素治基因，在较长时间使用青霉素治疗可能使得这些基因发生突变，从而导致疗可能使得这些基因发生突变，从而导致PBPs结构的改变，使结构的改变，使PBPs与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产生耐与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产生耐药性。药性。2.淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术淋病奈瑟菌

40、耐药检测的分子生物学技术：详细描述详细描述1种种 DNA 测序、PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术病例分析病例分析q某位患者临床表现为，实验室检查为，疑为结核分枝杆结核分枝杆菌菌感染，感染，请同学们根据分子生物学检验学所学的知识设计实验：如何进行快速特异性检测？（至少例举四种方法，详细介绍一种）q解答重点：解答重点：q方法列举：方法列举：PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂交法(LPA)、链替代扩增技术(SDA)、扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTDT)、基因芯片技术、测序等q以real-time PCR为例：q1.提取该患者外周抗凝血中的提取该患者外周抗凝血中的DNAq2.从基因库中获取从基因库中获取结核分枝杆菌结核分枝杆菌 16S rRNA基因的序列，利用软件设计一对特异性引物和一条探针，探针两侧分别标记上Q和R荧光分子。q3.real-time PCR 扩增6S rRNA基因上的特异片段q4.电泳鉴定，与标准品比对分析诊断