一种新的乙肝诊断血清免疫学指标乙肝病毒大蛋白课件.ppt

1、一种新的乙肝诊断血清免疫学指标乙肝病毒大蛋白乙型肝炎流行现状n乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。n全球60亿人口中，约1/2人口生活在HBV高流行区，n约20亿人证明有HBV感染，34亿人为HBV慢性感染，其中25%40%最终将死于肝硬化和肝癌。n全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡约75万例 中国乙型肝炎流行现状p(一)HBeAg阴性活动期肝炎增多 p(二)HBV变异株增加HBV的突变率较高，HBeAg阴性活动期肝炎n临床特点：(1)转为肝硬化和肝癌比例较大；(2)与年龄相关：患者年龄较大；(3)疾病自发或持续减轻极少发生；(4)何时停药难以确定；(5)治疗后复发率高。HBeA

2、g阴性活动期肝炎nHBeAg阴性乙肝与HBeAg阳性乙肝不同点：(1)慢性肝炎病情不减轻；(2)生化学和病毒学标志反复升高；(3)可3040年无症状；(4)约45岁左右发生肝硬化；(5)10年后约25%发生并发症。HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg 阴性的慢性乙肝流行率升高原因：(1)持续免疫压力导致突变株选择；(2)长期治疗导致病毒变异；(3)前C和C启动子变异；(4)检测方法的灵敏度提高。HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg 阴性活动期肝炎临床诊断现状：(1)传统“两对半”指标不能反映此类患者HBV复制程度；(2)缺乏指导合理治疗的指标；(3)HBV DNA检测不易于各级医疗机构广泛开展；(

3、4)临床上急需能够反映HBV复制程度及指导治疗的指标。抗病毒治疗效果监测n临床上用于抗病毒治疗的药物干扰素核苷类似物 抗病毒治疗效果监测n临床上缺乏评估抗病毒治疗效果的指标。n以HBV DNA阴转作为治疗的终点不恰当，此时停药病情易反复。乙肝病毒实验室检测的缺陷 抗病毒治疗效果评价血清学指标缺乏 临床上评价抗乙肝病毒治疗效果时存在一个很大的问题，即其评价指标主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。诚然，这些指标对临床医生判断患者病情而言非常重要和实用，也是临床医生选用抗乙肝病毒药物时的依据，然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制

4、活跃导致乙肝复发则缺乏客观而有效的指标。乙型肝炎血清学诊断技术新突破新突破乙肝病毒大蛋白（乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前）前S区区 酶免定量试剂盒酶免定量试剂盒 n -直接直接定量检测定量检测乙肝大蛋白乙肝大蛋白 n -不用分开检测前不用分开检测前S1和前和前S2HBV-LP诊断试剂新颖之处n采用病毒样颗粒制作针对构象结构的高活性抗体n同时检测前S1和前S2n进行定量检测，用于评估抗病毒治疗效果和预后n诊断HBeAg阴性活动期肝炎的唯一血清学指标n评估治疗效果及判定治疗终点唯一血清学指标n大蛋白完全消退意味患者预后良好乙肝病毒包膜蛋白研究进展n2019-2019年 发现大蛋白前S区有复杂构象

5、结构n2019年 发现大蛋白具有反式激活病毒复制的作用n2019年 发现导致肝细胞病变及凋亡的主要原因是大蛋白n2019年 实验室成功构建针对构象型抗原的单克隆抗体n2019年 国内公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶联免疫定量试剂盒Hepatitis B乙型肝炎HBV模型HBV包膜蛋白HBV的表面抗原的组成HBV病毒结构成分 HBV-LP与病毒复制密切相关HBV Dane 管形 球型 血流中的分布 L-HBs 大蛋白存在 存在 不含仅病毒复制期存在M-HBs中蛋白存在 存在 1%含量 非复制期少量存在S-HBs小蛋白存在 存在 存在 存在根据检测血液中大蛋白的有无，判断病毒携带者体内的HBV病毒

6、是否在进行复制。乙肝病毒包膜蛋白 preS特性:(1)暴露在病毒颗粒表面(2)高免疫原性(3)参与了病毒与细胞受体的相互作用(4)诱导抗感染的保护性抗体的产生 Neurath AR,Kent SB,Strick N,Parker K.Delineation of contiguous determinants essential for biological functions of the pre-S sequence of the hepatitis B virus envelope protein:its antigenicity,immunogenicity and cell-rece

7、ptor recognition.Ann Inst Pasteur Virol.1988 Jan-Mar;139(1):13-38.乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究Prange R,Streeck RE.Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins.EMBO J 2019;14:247-256Lambert C.et al.Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope pr

8、oteins J.General Virology 2019 85,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究HBV病毒颗粒表面的病毒颗粒表面的PreS已经被证实具有独立已经被证实具有独立的的结构域和天然构象结构域和天然构象很多研究致力于表达并观测很多研究致力于表达并观测PreS的结构，但是的结构，但是极少成功。其原因是单独表达的极少成功。其原因是单独表达的PreS很容易被很容易被蛋白酶所降解。蛋白酶所降解。(A)内质网（ER）膜上乙肝大蛋白的拓扑结构模型。(B)病毒体包膜上的乙肝大蛋白的拓扑结构模型。Volker Bruss,Xuanyong Lu1,Reiner Thomsse

9、n and Wolfram H.Gerlich.Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B virus large envelope protein.The EMBO Journal vol.13 no.10 pp.2273-2279,1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究HBV L包膜蛋白（大蛋白）的结构域和穿膜拓扑结构 A.大蛋白的构成组分，含preS1、preS2及S结构 B.大蛋白在内质网（ER）膜上的拓扑结构Carsten Lambert,Sylvia Mann and R

10、einhild Prange.Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins.Journal of General Virology(2019),85,12211225乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究 AA99169形成一个环状结构，这一序列横跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究Volker Bruss Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Re

11、search 106(2019)199209 29 September 2019AA99169L蛋白i-pre-S形式的功能模式图。黑点表示L蛋白pre-S结构 略去S和M蛋白分泌的病毒体表面的e-pre-S结构很可能具有结合病毒受体的功能。目前的数据显示L蛋白的i-pre-S结构是一种蛋白矩阵，在病毒体的形成过程中负责与核壳体相接触，包装外膜。VOLKER BRUSS*AND KERSTIN VIELUF.Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Parti

12、cle Morphogenesis.JOURNAL OF VIROLOGY,Nov.2019,p.66526657 Vol.69,No.11u肝炎病毒物种特异性的感染取决于病毒进入的水平，并由病毒L蛋白上的pre-S结构决定。u Arg 103和Ser 124之间的序列在不同的HBV之间是高度保守的。uArg 103和Ser 124之间的 pre-S序列对于HBV的形成具有重要功能。横跨前和前之间横跨前和前之间乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究VOLKER BRUSS.A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the Large Hepati

13、tis B Virus Envelope Protein Required for Virion Formation.JOURNAL OF VIROLOGY,Dec.2019,p.93509357 Vol.71,No.12TAKASHI ISHIKAWA AND DON GANEM.The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian hepatitis B viruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.92,pp.6259-6263,July 2019 D

14、etermination of the Minimal Distance between the Matrix and Transmembrane Domains of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Journal of Virology,June 2019,p.7918-7921,Vol.79,No.120192-538X形成特殊的矩阵结构跨膜区，维持它们正常结构的最短距离是个乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究 Pre-S的反式激活作用乙肝病毒大分子表面抗原（大蛋白）是一种转录活化因子The hepatitis B virus la

15、rge surface protein(LHBs)is a transcriptional activator.Virology.2019Nov1;225(1):235-9.Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H.Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J Virol,2019;76;1462-8.n乙肝鸭模型证实由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制n这个研究具有临床意义,对于大蛋白阳性而DNA阴性患者容易停药反跳具有参考意义.亚病毒颗粒

16、上pre-S的反式激活作用n原 文：Ultrastructural Analysis of Hepatitis B Virus in HepG2-TransfectednCells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesisn作 者：PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAUn作者单位：Laboratoire de Biologie Cellulaire,EP CNRS 117,Faculte de Medecine de Tours,2 bis Boulevard Tonnelle,F-37

17、032 Tours Cedex France.n发表刊物：HEPATOLOGY Vol.28,No.4,2019n n在乙肝病毒感染的在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤细胞中对亚病毒纤维体的形态发生进行的超微结构分析维体的形态发生进行的超微结构分析大蛋白与肝细胞病变研究大蛋白的过量表达,管状颗粒在细胞内堆积,导致体外培养的细胞5天内死亡nChisari等和Fernandes等已经证实，在转基因小鼠中过量表达大的表面蛋白会使肝细胞凋亡并且产生慢性肝炎。然而，在他们模型中的这种损伤相对比较温和，没有小鼠死于肝功能衰竭.n转基因小鼠的肝细胞带有这种蛋白L的积累滞留，则会发展为细胞的损伤作用，

18、它会诱导肝的再生，在这个模型中最终导致肝癌 大蛋白导致肝细胞病变研究大蛋白是导致FCH中肝细胞损伤,纤维化的主要原因FCH与肝细胞内大蛋白过量表达n蛋白L的滞留也被发现和一种独特的综合症，即纤维淤胆性肝炎（FCH）相联系，它的特征为肝细胞的空气球化和有着显著的胆汁阻塞，但是它一般只有很少的炎症发生，它发生于免疫抑制的乙肝携带者。来自于发生了FCH的病人的肝脏样品，通过电镜观察发现在细胞内膜系统中有着同样的乙肝亚病毒包膜纤维体的积累。2019年国际肝病杂志n实验证实，表达的乙肝大表面蛋白致使培养的肝细胞在一些天内死亡。n乙肝大的表面蛋白会致使体外培养的细胞的液泡化和细胞凋亡。这些结果和FCH下的

19、肝脏病理情况相当地相似，国内pre-S研究（部分）n文献一：Establishment and preliminery use of hepatitis B Virus Pre S1/2 antigen assay World Journery of Gastroenterology 99年军事医学科学院所n文献二 xpression and purification of the complete preS region of hepatitis B Virus World Journal of Gastroenterology 2019年中科院上海生化和细胞所抗原表位n目前生物科学领域，对

20、天然表位的研究借助现代科学技术的进步，对表位已经有比较深刻的认识。n表位的构成方式至少有两种：由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，称为顺序（sequential）表位或线性(linear)表位。顺序表位是蛋白分子的一级结构，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改变的影响。由分子内不连续的23个氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构构成，称为构象(conformational)表位；有时候，呈螺旋式排列的连续肽链序列也可起到构象表位的作用。多肽无法模拟构象表位n商品化的前S1 定性检测试剂上市，其单抗是用AA21-47化学合成的多肽而制作的。而应用该多肽免疫制作的抗体在科研中就已经发

21、现，只能检测到微弱的抗-pre-S1抗体的产生多肽无法模拟构象表位nSchodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，诱导生成的抗pre-s1抗体的滴度只有160，n上海生化所改进应用pre-S1-BSA偶联复合物免疫Balb/c小鼠，也只能检测到微弱的抗Pre-S1的活力，目前临床使用乙肝前S1以及前S2试剂n大部分研究主要集中在前大部分研究主要集中在前S1区、前区、前S2区。研究表明区。研究表明前前S1区、前区、前S2区蛋白及其抗体都与区蛋白及其抗体都与HBV-DNA、HBeAg、肝脏损害、乙肝的转归等都有极其密切的、肝脏损害、乙肝的转归等都有极其密

22、切的关系。关系。n临床应用：前临床应用：前S1试剂、前试剂、前S2试剂诊断的结果与试剂诊断的结果与HBV-DNA、HBeAg 三者之间有一定的关系，但符合三者之间有一定的关系，但符合率却只有率却只有0%，甚至更低。，甚至更低。杨海林等 完整病毒颗粒Dane颗粒标志物PreS1蛋白药盒的研制 上海医学检验杂志2019 vol.10:204-206杨海林等 抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（2047）多肽的制备、性质和应用。生物化学与生物物理学报 1994 vol 26 145-151p使用针对化学合成多肽的单克隆抗体，p无法定量监测，无法用于疗效观察p临床应用年，灵敏度不理想，目前临床使用乙肝前S

23、1以及前S2试剂乙肝大蛋白定量诊断试剂n应用结构生物学、蛋白晶体学的研究，研发出针对乙肝病毒前S区的构象型单抗，n大大提高了乙肝病毒感染者中前S区抗原即LP大蛋白的检出率，n临床应用表明大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的符合率高度符合（90%）。n比原来的前S1试剂效果大大提高，可作为病毒复制的一个指标。乙肝大蛋白re-S抗原蛋白晶体结构HBV-lp晶体结构空间模型针对大蛋白构象表位单抗研制简要过程（本方法是我们已经申请的专利的一部分）n获得体外重组的PRE-S抗原n获得多抗，亲和层析n从强阳性标本中获得病毒样颗粒n病毒样颗粒制作抗体大蛋白试剂临床研究1、HBV DNA阳性标本中阳性标本中HB

24、VLP的阳性符合率的阳性符合率考考 核核 单单 位位HBV DNA（）（）HBVLP（）（）例（次）数例（次）数例（次）数例（次）数比例（）比例（）北京地坛医院126825494.78北京地坛医院2（治疗系列）115214998.03解放军传染病研究所17013579.41辽宁沈阳传染病医院14313493.71浙江省湖州中心医院（治疗系列）213312896.24合合 计计84878392.33注：1 阿德福韦抗病毒治疗患者43例，共检出HBV DNA阳性152次；2 拉米夫定抗病毒治疗患者51例，共检出HBV DNA阳性133次。2、不同、不同HBV DNA拷贝数中拷贝数中HBVLP阳性率

25、以及阳性率以及OD值比较值比较大蛋白试剂临床研究组别HBV DNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例数阳性例数阳性率（）大蛋白 OD1104(阴性)842321.380.2660.0442104432967.440.4160.0813105634673.020.5040.2054106242187.500.8980.1805107171694.121.2750.31961082323100.001.4280.238注：解放军传染病研究所，HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP OD值的相关系数r=0.945大蛋白试剂临床研究组别HBV DNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例(次)数阳性例(次

26、)数阳性率（）阳性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465106808010086.61合计合计/29528195.25/注：北京地坛医院与沈阳传染病医院汇总，其中北京地坛医院为阿德福韦抗病毒治疗患者标本。HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP含量（ng）的相关系数3、不同、不同HBV DNA拷贝数中拷贝数中HBVLP阳性率以及含量比较阳性率以及含量比较r=0.935大蛋白试剂临床研究4、HBVLP试剂与乙肝前试剂与乙肝前S1试剂比较试剂比较大蛋白试剂临床研究考考 核核 单

27、单 位位HBVDNA（）（）HBVLP（）（）乙肝前乙肝前S1（）（）例数例数例数例数 比例（）比例（）例数例数比例比例（）（）北京地坛医院26825494.7817665.67解放军传染病研究所17013579.419757.06合合 计计43838988.8127362.33大蛋白试剂临床研究考考 核核 单单 位位HBVDNA（）（）HBVLP（）（）HBeAg（）（）北京地坛医院北京地坛医院沈阳传染病医院沈阳传染病医院例数例数例数例数比例比例（）（）例数例数比例比例（）（）39136894.1217745.275、HBV DNA、HBeAg与与HBVLP三者在乙肝患者中的比较三者在乙肝患

28、者中的比较5、HBV DNA、HBeAg与与HBVLP三者在乙肝患者中的比较三者在乙肝患者中的比较大蛋白试剂临床研究HBV DNA（）（）HBeAg()HBeAg()合计合计177#214*391HBVLP（）（）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注：#其中北京地坛医院109份；沈阳传染病医院68份 *其中北京地坛医院159份；沈阳传染病医院55份6、不同、不同HBV模式的患者中模式的患者中HBVLP与与HBV DNA的比较的比较大蛋白试剂临床研究HBV M 模 式 例数 HBV DNA（）（）例数 阳性率(%)HBVLP（）（）例数 阳性率(%)HBsAg(+

29、)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合计合计48540182.6839882.06大蛋白试剂临床研究7、HBVLP试剂盒抗干扰能力的考评试剂盒抗干扰能力的考评考核单位考核单位干扰血清干扰血清HBVLP结果结果所患疾病所患疾病例数例数阳性阳性例数例数阳性率阳性率（）（）北京地坛医院北京地坛医院甲肝800丙肝800戊肝800两种肝炎混合感染*600沈阳

30、传染病医院沈阳传染病医院丙肝2000合计合计/5000注：*含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份8、HBVLP试剂盒的特异性考评试剂盒的特异性考评大蛋白试剂临床研究考核单位考核单位考评标本考评标本HBVLP结果结果标本来源标本来源例数例数阳性阳性例数例数阴性阴性例数例数特异性特异性（）（）河北省血液中心河北省血液中心正常献血员21183211599.86解放军传染病研究所解放军传染病研究所体检健康者1000100100北京地坛医院北京地坛医院体检健康者57057100合合 计计/22753227299.87大蛋白试剂临床研究9、HBVLP用于抗病毒治疗的监测用于抗病毒

31、治疗的监测n北京地坛医院进行了阿德福韦治疗患者的过程监测n浙江湖州中心医院进行了拉米夫定治疗患者的过程监测n北京大学生物系进行了干扰素治疗患者的过程监测北京地坛医院阿德福韦治疗监测地坛阿德福韦治疗系列血清典型病例典型分析药物治疗无效病例治疗现有效果后反跳治疗先有效后反跳治疗先有效后反跳治疗先有效后反跳浙江湖州中心医院拉米夫定治疗监测p抗病毒治疗过程中HBV DNA阴转不能做为治疗终点的指标，HBV DNA阴转之后患者的病情会出现反跳。p HBVLP可以做为评估抗病毒治疗效果的指标，HBVLP的完全消退提示抗病毒治疗较为彻底，此时选择停止用药可以避免患者病情的反跳。HBV-LP完全消退，年内不反

32、弹完全消退，个月内不反弹高，治疗无效高，治疗无效与疾病反弹与疾病反弹浙江湖州中心医院拉米夫定治疗监测 拉米夫定抗治疗过程中HBV DNA的消减晚于HBV DNA的消减，由于抗病毒治疗过程中肝内HBV DNA的消减晚于血液中的消减晚于血液中HBV DNA的消减，的消减，试验结果显示在治疗过程中HBVLP的消减可能与肝内HBV DNA的消减存在良好相关关系。晚于消退，与同步浙江湖州中心医院拉米夫定治疗监测 HBVLP可以作为一个评估抗病毒治疗效果以及判定治疗终点的指标，能够合理能够合理的指导患者的用药，避免过早停药导致的的指导患者的用药，避免过早停药导致的病情反复。病情反复。北大生物系干扰素治疗监

33、测应答明显组反跳组应答不明显组sAg+S2L P+DNA+eAg+乙肝病毒成分直接检测集合大蛋白涵盖大蛋白涵盖HBeAg,HBeAg,并稍晚于血液中并稍晚于血液中DNADNA的消退的消退乙肝大蛋白以及乙肝标志物消减曲线HBeAgHBV DNA大蛋白大蛋白HBsAg乙肝大蛋白试剂已经申请专利乙肝大蛋白临床检测意义p1、病毒感染者体内病毒复制的确切血清学指标、病毒感染者体内病毒复制的确切血清学指标p2、持续阳性者（特别是小三阳）预后观察、持续阳性者（特别是小三阳）预后观察p3、临床肝炎治疗合理用药指导，避免过度用药、临床肝炎治疗合理用药指导，避免过度用药p4、抗病毒治疗的效果观察、抗病毒治疗的效果

34、观察,停药时间判断停药时间判断.p5、体检加查本指标可以判断个体是否有感染性、体检加查本指标可以判断个体是否有感染性乙肝大蛋白临床检测意义 我国卫生资源分配不一，尚有很多医院不具备我国卫生资源分配不一，尚有很多医院不具备HBV-DNA PCR的实验水平。而免疫测定技术因其有的实验水平。而免疫测定技术因其有效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主导地位，在我国大中小型医院普遍应用，本试剂的诞导地位，在我国大中小型医院普遍应用，本试剂的诞生有利于中小型医院也掌握血液内病毒复制指标的检生有利于中小型医院也掌握血液内病毒复制指标的检测方式。进而提高临床大夫的诊断和治疗水平。并对测方式。进而提高临床大夫的诊断和治疗水平。并对临床小三阳治疗有辅助诊断的意义。临床小三阳治疗有辅助诊断的意义。乙肝大蛋白临床检测意义p1、填补传统两对半试剂的空白p2、弥补HBV DNA检测的不足p3、诊断HBeAg阴性活动期肝炎唯一血清学指标p4、抗病毒治疗终点判定的唯一血清学指标