第三章酶的生产课件.ppt

1、第三章酶的生产第三章酶的生产2022-9-27第三章酶的生产第三章第三章 酶的生产制备酶的生产制备 酶的生产方式酶的生产方式1.提取法提取法:植物、动物、微生物植物、动物、微生物2.化学合成法化学合成法第三章酶的生产第三章酶的生产生物合成法：生物合成法：利用植物、动物、微生物细胞合成。利用植物、动物、微生物细胞合成。上个世纪上个世纪50年代起利用微生物生产酶。年代起利用微生物生产酶。1949年细菌发酵生产淀粉酶年细菌发酵生产淀粉酶 上个世纪上个世纪70年代以来利用植物细胞和年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。动物细胞培养技术生产酶。木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜木瓜细胞培养生产木瓜

2、蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂产血纤维蛋白溶酶原激活剂第三章酶的生产动植物细胞培养的特殊性：动植物细胞培养的特殊性：1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍，千倍，2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚更甚3、生长速率比微生物低，生长倍增时间、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长，和发酵周期均更长，4、对营养的要求较微生物复杂，动物细、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分胞往往需要添加血清和其他营养成分第三章酶的生产3

3、、酶的发酵生产、酶的发酵生产经过预先设计，通过人工操作控制，利经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。酶的过程，称为酶的发酵生产。第三章酶的生产第一节第一节 酶的生产菌种酶的生产菌种一、生产菌种一、生产菌种1.细菌细菌 芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌2.霉菌霉菌 黑曲霉、米曲霉、木酶黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌酵母菌 啤酒酵母、假丝酵母啤酒酵母、假丝酵母4.放线菌放线菌 链霉菌链霉菌第三章酶的生产第三章酶的生产第三章酶的生产二、产酶菌种的要求二、产酶菌种的要

4、求（1 1）不是致病菌及产生有毒物质或其他）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。应用的安全。（2 2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期快，产酶量高，有利于缩短生周期（3 3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。易受噬菌体侵袭。（4 4）目标酶的产量要高，性能符合应用）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。胞外酶。（5 5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种

5、的产）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。第三章酶的生产 三三.产酶微生物的分离和筛选产酶微生物的分离和筛选 1)1)样品的采集样品的采集:从富含从富含该酶作用底物该酶作用底物的场所采集样品的场所采集样品 2)2)富集培养富集培养:投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分离获得微生物的纯培养（分离获得微生物的纯培养（pure culturepure culture）。）。4)4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。复筛：选出产酶水平相对

6、较高的菌株，以质为主。第三章酶的生产 -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选第三章酶的生产蛋白酶产生菌的获得方法蛋白酶产生菌的获得方法应用含酪蛋白的培养基应用含酪蛋白的培养基第三章酶的生产第二节第二节 酶的发酵技术酶的发酵技术一、培养基一、培养基 C/N:产酶促进剂产酶促进剂:诱导物诱导物 表面活性剂表面活性剂二、发酵条件对产酶的影响二、发酵条件对产酶的影响 温度、温度、pH值、通风量值、通风量第三章酶的生产三、发酵方法三、发酵方法1 1、固体培养发酵：、固体培养发酵：培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目分，经

7、灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。2 2、液体深层发酵、液体深层发酵液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要方法。方法。3 3、固定化细胞发酵、固定化细胞发酵第三章酶的生产第三节第三节 提高酶产量的方法提高酶产量的方法一、酶合成的调节机一、酶合成的调节机制制1.操纵子操纵子调节基因：调节基因：阻遏蛋白阻遏蛋白 辅阻遏物辅阻遏物第三章酶的生产2、诱导和阻遏、诱导和阻遏诱导：诱导：诱导物的加入

8、后，酶才大量合成，诱导物的加入后，酶才大量合成，参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶阻遏：阻遏：末端代谢物阻遏：末端代谢物阻遏：反馈阻遏，合成代谢中的关键酶反馈阻遏，合成代谢中的关键酶 分解代谢物阻遏：分解代谢物阻遏：第三章酶的生产 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生

9、长在乳糖培养基上时，细胞内有）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。第三章酶的生产调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性）基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结

10、构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）诱导诱导第三章酶的生产 2.2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象：实验：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸

11、的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。第三章酶的生产 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达合，结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化生变化,与操纵基因结合，结构基因不能与操纵基因结合，结构基因不能表达表达第三章酶的生产酶酶的的

12、诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋阻遏蛋白白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结

13、合,结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物第三章酶的生产3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结

14、果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。第三章酶的生产分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象：实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二二次生长现象次生长现象”(diauxie”(diauxie或或biphasic grow

15、thbiphasic growth）。）。这一现象又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）,亦称亦称降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。第三章酶的生产分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖葡萄糖分解代

16、分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态第三章酶的生产三、提高酶产量的策略三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸）1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺

17、陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种基因工程育种 第三章酶的生产二、提高酶产量的策略二、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸）1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分

18、解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种基因工程育种 第三章酶的生产（二）（二）.通过条件控制提高酶产量通过条件控制提高酶产量（1）添加诱导物）添加诱导物 选择适宜的诱导物及浓度选择适宜的诱导物及浓度:诱导物：诱导物：酶的作用底物酶的作用底物 酶作用底物的前体酶作用底物的前体 酶的反应产物酶的反应产物 酶的底物类似物或底物修饰物等酶的底物类似物或底物修饰物等 IPTG/乳糖乳糖 纤维素纤维素/纤维二糖诱导纤纤维二糖诱导纤维素酶维素酶 第三章酶的生产（2）降低阻遏物浓度）降低阻遏物浓度 避免使用过于丰富的培养基和易被避免使用过于丰富的培养基

19、和易被利用的碳源，并设法阻止效应物的形成利用的碳源，并设法阻止效应物的形成和浓度的增加。和浓度的增加。流加和连续培养流加和连续培养第三章酶的生产（3）.其他其他 促进分泌：添加表面活性剂促进分泌：添加表面活性剂 离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用 表面活性剂表面活性剂 Tween80 非离子型非离子型 TritonX100 非离子型增加细胞通性非离子型增加细胞通性，添加产酶促进剂添加产酶促进剂 植酸钙镁，聚乙烯醇等植酸钙镁，聚乙烯醇等第三章酶的生产第四节第四节 酶发酵动力学酶发酵动力学 细胞生长速度细胞生长速度 产物生成速度产物生成速度 基质消耗速度基质消耗速度 环境因素的影响环境

20、因素的影响细胞生长动力学细胞生长动力学发酵产酶动力学发酵产酶动力学发酵动力学研究内容：发酵动力学研究内容：第三章酶的生产一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式微生物细胞的生长历程微生物细胞的生长历程第三章酶的生产按细胞生长和酶产生的关系，酶生物合成具按细胞生长和酶产生的关系，酶生物合成具有下列四种模式：有下列四种模式：1 1、同步合成型、同步合成型2 2、延续合成型、延续合成型3 3、中期合成型、中期合成型4 4、滞后合成型、滞后合成型第三章酶的生产1.1.生长偶联型（又称同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以

21、诱导，但不受分解代谢物阻遏酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的立即停止，表明这类酶所对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。第三章酶的生产2.2.生长偶联型中的特殊形式生长偶联型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶的合成受产物的反馈阻遏

22、或分解代谢物阻遏。所对应的所对应的mRNAmRNA是不稳定的。是不稳定的。枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 第三章酶的生产3.3.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的所对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线第三章酶的生产4.

23、4.非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 第三章酶的生产总结：影响酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的稳定性2）培养基中阻遏物的存在第三章酶的生产第三章酶的生产mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是影响酶生物合

24、成模型的主要因素。mRNA稳定性 代谢调节 产物生成模型同步合成型 (-)诱导 dP/dt=dX/dt 延续合成型 (+)诱导 dP/dt=dX/dtX中期合成型 (-)反馈阻遏 dP/dt=dX/dt （解除阻遏后）滞后合成型 (+)分解代谢物阻遏 dP/dt=X第三章酶的生产 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型（部分偶联）：延续合成型（部分偶联）：发酵过程中没有生长期和产发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。胞生长进入平衡期后，酶还可以

25、继续生成一段时间。对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。第三章酶的生产目的：提高产酶率和缩短发酵周期目的：提高产酶率和缩短发酵周期最理想的合成模式：延续合成型最理想的合成模式：延续合成型策略措施：策略措施：菌种选育：提高菌种选育：提高mRNA的稳定性，解除分的稳定性

26、，解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏。解代谢物阻遏和反馈阻遏。发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。氮源的使用，补料发酵）。降低产酶温度。降低产酶温度。第三章酶的生产二、细胞生长动力学二、细胞生长动力学微生物细胞生长的动力学方程：微生物细胞生长的动力学方程：第三章酶的生产Monod方程：方程：S S限制性基质浓度；限制性基质浓度；m m最大比生长速率；最大比生长速率；K Ks s MonodMonod常数常数第三章酶的生产倒数形式：倒数形式：第三章酶的生产三、产酶动力学三

27、、产酶动力学产酶动力学方程：产酶动力学方程：XX细胞浓度，以每升发酵液所含的干细胞细胞浓度，以每升发酵液所含的干细胞重量表示（重量表示（gDC/LgDC/L）第三章酶的生产固定化微生物细胞发酵产酶固定化微生物细胞发酵产酶一、固定化细胞发酵产酶的特点一、固定化细胞发酵产酶的特点1 1、提高产酶率、提高产酶率2 2、可以反复使用或连续使用较长时间、可以反复使用或连续使用较长时间3 3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失4 4、发酵稳定性好、发酵稳定性好5 5、缩短发酵周期，提高设备利用率、缩短发酵周期，提高设备利用率6 6、产品容易分离纯化、产品容易分离纯化7 7、适用

28、于胞外酶等胞外产物的生产、适用于胞外酶等胞外产物的生产第三章酶的生产第三章第三章 酶的生产和制备酶的生产和制备 第五节第五节 酶的分离纯化（酶的制备）酶的分离纯化（酶的制备）酶的提取和分离纯化酶的提取和分离纯化：将酶从细胞或培养基中抽提出来，将酶从细胞或培养基中抽提出来，获得与使用目的相适应的有一定纯度获得与使用目的相适应的有一定纯度和浓度的酶产品的过程。和浓度的酶产品的过程。第三章酶的生产两个基本环节：分离和纯化两个基本环节：分离和纯化 分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少引入杂质，得到粗酶液引入杂质，得到粗酶液 纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择

29、纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯度的酶。度的酶。第三章酶的生产酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的特点：特点：1、特定的一种酶在细胞中的含量较少，、特定的一种酶在细胞中的含量较少，2、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。前者给纯化带来了困难，而后者却迅速前者给纯化带来了困难，而后者却迅速找出纯化过程的关键所在。找出纯化过程的关键所在。理想的提取和分离纯化方法理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的：在提高酶的比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤

30、比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、工艺简单，成本低少、工艺简单，成本低第三章酶的生产一、原则一、原则1.防止酶失活防止酶失活 这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法 物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活2.分离纯化的环节的选择（经济、宜行）：分离纯化的环节的选择（经济、宜行）：纯化倍数、酶活回收率和重现性纯化倍数、酶活回收率和重现性 （衡量优劣）（衡量优劣）经济、可靠，建立灵敏、快速、特异、精确的检测经济、可靠，建立灵敏

31、、快速、特异、精确的检测（酶活和蛋白质的含量）手段。（酶活和蛋白质的含量）手段。3、分离步骤、方法和成本间的关系、分离步骤、方法和成本间的关系 提取、分离、纯化、制剂提取、分离、纯化、制剂第三章酶的生产策略：策略：酶产品的质量要求酶产品的质量要求设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或研究级）研究级）目标酶蛋白与主要杂质的性质目标酶蛋白与主要杂质的性质提取过程的设计应尽可能防止酶的损失，提取过程的设计应尽可能防止酶的损失，减少处理步骤。减少处理步骤。第三章酶的生产提取方法的经济性和可分析性提取方法的经济性和可分析性 尽量减少添加剂的使用尽量减少添加剂的使

32、用 尽早使用高效分离方法，将昂贵、费时的分尽早使用高效分离方法，将昂贵、费时的分离方法放在最后阶段。离方法放在最后阶段。酶活力、蛋白浓度、纯度测定方法可行性酶活力、蛋白浓度、纯度测定方法可行性剂型（液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、剂型（液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、结晶酶等）结晶酶等）第三章酶的生产第三章酶的生产 二、二、酶活力酶活力（一）（一）酶活力酶活力 酶活力酶活力activity：酶催化一定化学反应酶催化一定化学反应的能力。用酶催化的反应速度来表示酶的能力。用酶催化的反应速度来表示酶活力，即用单位时间内，单位体积中底活力，即用单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。物的减少量或

33、产物增加量来表示。转换频率：转换频率：单位时间转化的底物分子数。单位时间转化的底物分子数。Kcat,单位单位1/s第三章酶的生产（二）酶活力单位及比活力（二）酶活力单位及比活力 酶活力单位酶活力单位U（active unit）：是根据）：是根据某种酶在最适条件下，单位时间内被酶某种酶在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的生成量来作用的底物的减少量或产物的生成量来规定的，表示酶活力高低。规定的，表示酶活力高低。IU：umol/min Kat：mol/s 1 Kat=6107 IU 第三章酶的生产酶的比活力酶的比活力 指每指每mg酶蛋白（或每酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含蛋白氨）所含

34、的酶活力单位数即：比活力的酶活力单位数即：比活力=活力单位数活力单位数/酶酶蛋白（氮）蛋白（氮）mg 表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。第三章酶的生产一、基本过程一、基本过程（一）、（一）、材料（选择）预处理及破碎细胞材料（选择）预处理及破碎细胞 1.胞内酶和胞外酶胞内酶和胞外酶 2.破碎细胞破碎细胞（二）、（二）、固液分离（固液分离（离心或过滤）离心或过滤）酶的溶解性、稳定性酶的溶解性、稳定性第六节第六节 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程第三章酶的生产（三）、（三）、净化与脱色净化与脱色 絮凝剂絮凝剂 脱色处理脱色处理（四）、（四）、浓缩浓缩

35、 （热量法、沉淀分离、膜分离）（热量法、沉淀分离、膜分离）（五）（五）纯化、结晶纯化、结晶（干燥）（干燥）第三章酶的生产第三章酶的生产二、酶分离纯化方法二、酶分离纯化方法第三章酶的生产三、酶分离纯化中的一些数据（三、酶分离纯化中的一些数据（p93）1.总蛋白总蛋白 2.总活力总活力 3.比活力比活力 4.酶浓度酶浓度 5.纯化倍数（提纯倍数）纯化倍数（提纯倍数）6.产率（回收率）产率（回收率）第三章酶的生产第六节第六节 酶制剂酶制剂一、定义及分类一、定义及分类1定义：从生物中提取的具有生物催化能力的酶，辅以定义：从生物中提取的具有生物催化能力的酶，辅以其他成分，用于加速加工过程和提高产品质量的

36、产品。其他成分，用于加速加工过程和提高产品质量的产品。2.分类分类 （1）形态上分）形态上分:固体固体 液体液体 （2）用途：工业酶制剂、饲料酶制剂、食品酶制剂、）用途：工业酶制剂、饲料酶制剂、食品酶制剂、医药酶制剂和洗涤酶制剂医药酶制剂和洗涤酶制剂 （3）组成：单一酶制剂和复合酶制剂）组成：单一酶制剂和复合酶制剂 （4）含量：普通酶制剂和浓缩酶制剂）含量：普通酶制剂和浓缩酶制剂 （5）来源：）来源：（6）生产加工方法：游离酶制剂、固定化酶制剂、酶）生产加工方法：游离酶制剂、固定化酶制剂、酶试纸、酶电极等试纸、酶电极等第三章酶的生产二、工业酶制剂的要求二、工业酶制剂的要求1.减少不必要的副反应

37、，有利生物催化的减少不必要的副反应，有利生物催化的专一性专一性2.能够适应所催化反应的条件能够适应所催化反应的条件3.稳定性好，操作稳定性和储存稳定性稳定性好，操作稳定性和储存稳定性4.批次之间的实验稳定性好批次之间的实验稳定性好5.能够反复使用（固定化酶）能够反复使用（固定化酶）第三章酶的生产三、酶的保存三、酶的保存（一）失活机理（酶空间结构改变）（一）失活机理（酶空间结构改变）1.蛋白酶水解蛋白酶水解2.pH值改变值改变3.氧化作用氧化作用 变性剂、去污剂、巯基试剂变性剂、去污剂、巯基试剂4.热热 5.金属离子及其他基团金属离子及其他基团6.水活度水活度7.制作方式制作方式 颗粒状颗粒状第

38、三章酶的生产（二）酶活性的保护（二）酶活性的保护1.加入稳定剂加入稳定剂 无机盐（硫酸铵、氯化钠）、糖（蔗糖、乳糖等）、无机盐（硫酸铵、氯化钠）、糖（蔗糖、乳糖等）、多元醇（山梨醇、甘油等）或高分子聚合物（聚乙二多元醇（山梨醇、甘油等）或高分子聚合物（聚乙二醇）。醇）。2.加入防腐剂（抑制微生物）、惰性蛋白（加入防腐剂（抑制微生物）、惰性蛋白（BSA,牛血清蛋白）牛血清蛋白）3.加入金属螯合剂加入金属螯合剂4.抗氧化剂抗氧化剂 巯基乙醇巯基乙醇5.低温保存低温保存第三章酶的生产四、酶制剂的生产工艺过程四、酶制剂的生产工艺过程（一）液体酶制剂（一）液体酶制剂 酶发酵液酶发酵液 絮凝絮凝 板框过滤板框过滤 滤液滤液 超滤浓缩超滤浓缩 防腐和标准化处理防腐和标准化处理 成品成品 第三章酶的生产（二）固体酶制剂（二）固体酶制剂酶发酵液酶发酵液 絮凝絮凝 板框过滤板框过滤 滤液滤液 浓缩酶液浓缩酶液 填料吸附填料吸附 固体酶制剂固体酶制剂 粗酶粗酶第三章酶的生产2022-9-27第三章酶的生产