生物质谱技术与方法课件.ppt
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- 生物 技术 方法 课件
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1、质谱技术与方法质谱技术与方法质谱分析法质谱分析法(mass spectrometry,MS)是将化合物形成离子和碎片离子,按质荷比是将化合物形成离子和碎片离子,按质荷比(m/z)的不同进行分离,来进行成分和结)的不同进行分离,来进行成分和结构分析的构分析的方法。方法。所得结果用质谱图(亦称质谱,所得结果用质谱图(亦称质谱,MassSpectrum)表示。)表示。根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无根据质谱图提供的信息可以进行有机物及无机物的定性和定量分析、生物大分子的结构机物的定性和定量分析、生物大分子的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构
2、和组成分析等。面的结构和组成分析等。生物质谱生物质谱(Bio-mass spectrometry,Bio-MS)是用于生物分子分析的质谱技术。是用于生物分子分析的质谱技术。生物质谱要求测定上万甚至是几十万的生物质谱要求测定上万甚至是几十万的相对分子质量相对分子质量 。随着电喷雾电离(随着电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光)和基质辅助激光解吸电离(解吸电离(MALDI)技术的完善和成熟,)技术的完善和成熟,生物大生物大分子的质谱分析才得以实现。分子的质谱分析才得以实现。The Nobel Prize in Chemistry 2002for the development of methods
3、for identification andstructure analyses of biological macromoleculesfor their development of softdesorption ionisation methods formass spectrometric analyses ofbiological macromoleculesfor hisdevelopment ofnuclear magneticresonancespectroscopy fordetermining thethree-dimensionalstructure ofbiologic
4、almacromolecules insolution约翰约翰芬芬田中耕一田中耕一库尔特库尔特伍斯里伍斯里奇奇质谱法的基本原理质谱法的基本原理质谱分析的基本过程是使样品在离子源中质谱分析的基本过程是使样品在离子源中发生电离,生成不同质荷比的带电离子,发生电离,生成不同质荷比的带电离子,经加速电场的作用形成离子束,进入质量经加速电场的作用形成离子束,进入质量分析器,在其中再利用电场和磁场使其发分析器,在其中再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦,获得质谱图。生色散、聚焦,获得质谱图。质谱分析中,多种离子化技术均可使物质质谱分析中,多种离子化技术均可使物质分子失去外层价电子形成分子离子分子失去外层价电
5、子形成分子离子(molecular ion,M+),分子离子中的化),分子离子中的化学键还可以继学键还可以继续发生某些有规律的断裂而续发生某些有规律的断裂而形成不同质量的碎片离子(形成不同质量的碎片离子(fragment ion):):M M+碎片离子碎片离子 +中性分子中性分子被分析样品离子电离后经加速进入磁场时,其动被分析样品离子电离后经加速进入磁场时,其动能与加速电压及电荷能与加速电压及电荷z有关,即:有关,即:zeU=1/2mv2其中:其中:z为电荷数,为电荷数,e为元电荷(为元电荷(e=16010-19C),),U为加速电压,为加速电压,m为离子的质量,为离子的质量,v为离子初为离子
6、初加速后的运动速度。加速后的运动速度。具有速度具有速度v的带电粒的带电粒子进入质谱仪的质量分析器中,子进入质谱仪的质量分析器中,根据所选择的分离方式,最终各种离子按质荷比根据所选择的分离方式,最终各种离子按质荷比(mz)的不同实现分离。)的不同实现分离。质谱仪质谱仪质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器和检测系统。为了获得离子的良好分析,必须和检测系统。为了获得离子的良好分析,必须避免离子损失,因此凡有样品分子及离子存在避免离子损失,因此凡有样品分子及离子存在和通过的地方,必须处于真空状态。和通过的地方,必须处于真空状态。在进行质谱分析时,一般过程是:
7、通过合适的在进行质谱分析时,一般过程是:通过合适的进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器,按不同的适当的加速后进入质量分析器,按不同的mz进行分离。然后到达检测器,产生不同的信号进行分离。然后到达检测器,产生不同的信号而进行分析。而进行分析。质量分析器质量分析器检测器检测器样品导样品导入系统入系统离子源离子源真空泵真空泵m/z计算机控制与计算机控制与数据处理数据处理相相对对丰丰度度质谱仪的构成质谱仪的构成DataSystemMassspectrum
8、outInletSystemMassAnalyzerIonSourceDetectorSampleinInlet systems:Ion sources:Mass analyzers:Simple vacuum lockHPLCGCElectrospray(ESI)MALDIFAB/LSIMSElectron ionization(EI)QuadrupoleTime-of-flightIon trapMagnetic sectorFTMSMass Spectrometer SchematicVacuum envelope离子源离子源(ion source)质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子
9、质谱仪中将分子转化为离子的装置称为离子源源(ion source)。由于离子化所需要的能量。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很随分子不同差异很大,因此,对于不同的分大,因此,对于不同的分子应选择不同的离解方法。子应选择不同的离解方法。通常将能给样品较大能量、生成较多碎片离通常将能给样品较大能量、生成较多碎片离子的电离方法称为子的电离方法称为硬电离方法硬电离方法(如电子轰击(如电子轰击离子化,离子化,EI),而给样品较小能量、),而给样品较小能量、碎片离碎片离子较少或不生成碎片离子的电离方法称为子较少或不生成碎片离子的电离方法称为软软电离方法电离方法。生物质谱中有代表性的离子源生物质谱中有代
10、表性的离子源1电喷雾电离电喷雾电离(Electrospray Ionization,ESI)2离子喷雾电离(离子喷雾电离(Ion spray Ionization,ISI)3大气压化学电离大气压化学电离(Atmospheric PressureChemical Ionization,APCI)4基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离(Matrix AssistedLaser Desorption Ionization,MALDI)5快原子轰击电离快原子轰击电离(Fast Atom BonbardmentIonization,FAB)离子源是质谱仪的心脏,可以将离子源离子源是质谱仪的心脏,可以
11、将离子源看作是离子化反应器,样品在其中发生看作是离子化反应器,样品在其中发生一系列的特征裂解反应,反应在很短时一系列的特征裂解反应,反应在很短时间(间(10-11s)内发生,所以可以快速地获)内发生,所以可以快速地获得质谱图。得质谱图。质量分析器质量分析器质量分析器是质谱仪的核心,它将离子质量分析器是质谱仪的核心,它将离子源产生的离子按其质量和电荷比(质荷源产生的离子按其质量和电荷比(质荷比比m/z,m离子的质量数,离子的质量数,z离子携离子携带的电荷数)的不同带的电荷数)的不同在空间的位置在空间的位置时间的先后或轨道的稳定与否进行分离时间的先后或轨道的稳定与否进行分离,以便得到按质荷比(以便
12、得到按质荷比(m/z)大小顺序排列)大小顺序排列而成的而成的质谱图。质谱图。质量分析器质量分析器(mass analyzer)的种类的种类1.磁质量分析器磁质量分析器(单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器,双聚双聚焦质量分析器焦质量分析器)2.四极质量分析器四极质量分析器(四极杆滤质器四极杆滤质器)3.飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器(TOF)4.离子阱离子阱(Ion Trap)质量分析器质量分析器5.离子回旋共振离子回旋共振质量分析器质量分析器其中其中,234是目前生物质谱是目前生物质谱分析中常分析中常用的质量分析器用的质量分析器检测器检测器1.直接电检测器直接电检测器2.电子倍增器电子倍增
13、器3.闪烁检测器闪烁检测器4.微通道板微通道板计算机控制与数据处理系统计算机控制与数据处理系统1.监控各单元的工作状态监控各单元的工作状态,实现质谱仪的实现质谱仪的全自动操作全自动操作.2.数据的采集和简化数据的采集和简化.3.质量数的转换质量数的转换.4.扣除本底或相邻组分的干扰扣除本底或相邻组分的干扰.5.谱峰强度归一化谱峰强度归一化.6.标出高分辨质谱的元素组成标出高分辨质谱的元素组成.7.用总离子流对质谱峰强度进行修正用总离子流对质谱峰强度进行修正.8.谱图的累加谱图的累加平均平均.9.输出质量色谱图输出质量色谱图.10.单离子检测和多离子检测单离子检测和多离子检测.11.谱图检索谱图
14、检索.质谱图质谱图质谱分析中,按各离子质谱分析中,按各离子m/z的顺序及相对的顺序及相对强度大强度大小记录分析结果的图谱即为质谱小记录分析结果的图谱即为质谱图。由于图谱中离子的质量及相对强度图。由于图谱中离子的质量及相对强度是各物质所特有的,即反映了物质的性是各物质所特有的,即反映了物质的性质和结构特点,因此通过质谱解析可以质和结构特点,因此通过质谱解析可以进行物质的成分和结构分析。进行物质的成分和结构分析。常见的质谱图是经过计算机处理后得到常见的质谱图是经过计算机处理后得到的棒图(的棒图(bar graph)。)。常见的质谱图是经计算机常见的质谱图是经计算机处理的棒图处理的棒图.图中图中,纵
15、坐纵坐标表示离子的标表示离子的相对丰度相对丰度(以质谱中最强以质谱中最强峰的高度为峰的高度为100%,并将此并将此峰称位基峰峰称位基峰,其余峰按与其余峰按与基峰的比例加以表示基峰的比例加以表示,又又称为相对强度称为相对强度);横坐标表横坐标表示离子的质荷比示离子的质荷比.根据峰位根据峰位(棒位棒位)可进行定可进行定性鉴别性鉴别;根据相根据相对丰度可对丰度可进行定量测定进行定量测定.15282931(基峰基峰)32(分子离子峰分子离子峰)33100806040201020304050m/z相相对对峰峰强强棒图棒图(bar graph)CH3OH%Intensity1239.41679.82120
16、.22560.6Mass(m/z)03001.00799.01020301001480.601567.46908070605040804.682044.211738.351570.451439.651894.26 2047.21927.77843.872470.782210.101923.271724.381000.701209.841391.671574.122661.87 2807.672066.13牛血清蛋白(牛血清蛋白(BSP)酶解产物的质谱图)酶解产物的质谱图Voyager Spec#1BP=1480.6,812710030%Int.1009080706050403494349534
17、9634973498349935003501350235033497.64223496.65413498.62563495.65453499.6528203500.65953501.6502Resolution 20,000m/z胰岛素的高分辨质谱图胰岛素的高分辨质谱图质谱仪的主要性能指标质谱仪的主要性能指标衡量质谱仪整体性能的主要指标有:衡量质谱仪整体性能的主要指标有:质量范围质量范围分辨率分辨率质量准确度质量准确度灵敏度灵敏度扫描速度等扫描速度等质量分析器质量上限(m/z)质量准确度(u)分辨率(R)扫描速度(u/s)适用范围四极杆质谱40000.1500300040006000小分子、多
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