生物化学：RNA的生物合成(转录)课件.ppt

1、RNA Biosynthesis,Transcription参与转录的物质参与转录的物质原料原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板模板:DNA酶酶:RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)其他蛋白质因子其他蛋白质因子RNARNA的生物合成体系的生物合成体系第一节第一节一、一、DNADNA模板模板 DNA双链中按碱基配对规律指引转录生成双链中按碱基配对规律指引转录生成RNA的一的一股单链，称为股单链，称为模板链模板链(template strand)，也称作，也称作反意反意义链、负链义链、负链或或Watson链链。其碱基。其碱基相对的另一股单链是相对的另一股

2、单链是编码链编码链(coding strand)，也称为，也称为有意义链、正链有意义链、正链或或Crick链链。其碱基。其碱基与与mRNA一致（一致（除除UT）。）。5GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 55GCAGUACAUGUC 3NAla Val His Val C编码链编码链模板链模板链mRNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译不对称转录不对称转录(asymmetric transcription)不同基因的模板链与编码链，在不同基因的模板链与编码链，在DNA分子上并非永远分子上并非永远在同一条单链上。在同一条单链上。在在DNA分子双链某一区段上，

3、一股链用作模板指引转分子双链某一区段上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录录，另一股链不转录。核心酶核心酶(core enzyme)催化转录延长催化转录延长全酶全酶(holoenzyme)活细胞转录起始需要活细胞转录起始需要（二）真核生物的（二）真核生物的RNA聚合酶聚合酶 种种类类对对鹅鹅膏膏蕈蕈碱碱的的反反应应45S-rRNAhnRNA5S-rRNAtRNAsnRNA耐耐受受极极敏敏感感中中度度敏敏感感转转录录产产物物三、启动子三、启动子5 3 3 5 结构基因结构基因调控序列调控序列RNA-polDNA模板上与模板上与RNA聚合酶及其他蛋白因子聚合酶及其他蛋白因子结合形成转录起始复合

4、物的部位，称为结合形成转录起始复合物的部位，称为启动子启动子(promoter)。RNA聚合聚合酶保护法酶保护法目目 录录开始转录开始转录T T G A C AA A C T G T-35 区区(Pribnow box)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区区1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物启动子保守序列原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点辨认位点(recognition site)5 5 RNA聚合酶保护区聚合酶保护区结构基因结构基因3 3 转录起始点多为嘌呤转录起始点多为嘌呤，常见的序列，常见的序列CAT,A为转录起始点为转

5、录起始点 TATA盒盒 CAAT盒盒 GC盒盒 增强子增强子 顺式作用元件顺式作用元件 结构基因结构基因-GCGC-CAAT-TATA转录起始转录起始真核生物启动子保守序列真核生物启动子保守序列转录过程转录过程The Process of Transcription 第二节第二节 一、转录起始一、转录起始转录起始需解决两个问题：转录起始需解决两个问题：1.RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域起始区域（启动子）（启动子）。2.DNA双链解开，使其中的一条链作为转录双链解开，使其中的一条链作为转录的模板，合成第一个磷酸二酯键。的模板，合成第一个磷酸二酯键。

6、（一）原核生物的转录起始（一）原核生物的转录起始转录起始不需引物！转录起始不需引物！RNA-pol的移动2.D N A 双 链 打 开，形 成双 链 打 开，形 成 开 放 转 录 复 合 体开 放 转 录 复 合 体(o p e n transcription complex)；DNA分子接近分子接近-10区域的部分区域的部分双螺旋解开后转录开始。双螺旋解开后转录开始。DNA双链解开的范围只在双链解开的范围只在17 bp左右，这比复制中形成的复制叉小得多。左右，这比复制中形成的复制叉小得多。1.RNA聚合酶全酶聚合酶全酶(2)识别并结合启动子，形成识别并结合启动子，形成闭合闭合转录复合体（转

7、录复合体（closed transcription comple）；3.在在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成第一聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成第一个磷酸二酯键：个磷酸二酯键：RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3 转录起始复合物转录起始复合物:因子清除因子清除5-pppG-OH +NTP 5-pppGpN-OH 3 +ppin转录起始过程：转录起始过程：第一个磷酸二酯键生成后，第一个磷酸二酯键生成后，转录复合体转录复合体的构象发生改变，的构象发生改变，亚基从转录起始复亚基从转录起始复合物上脱落，核心酶继续结合于合物上脱落，核心酶继续结合于DNA模模板上，酶沿板上，酶

8、沿DNA链前移，进入延长阶段。链前移，进入延长阶段。nE.coli的转录起始和延长的转录起始和延长（二）真核生物的转录起始（二）真核生物的转录起始转录起始上游区段比原核生物多样化转录起始上游区段比原核生物多样化RNA-pol不能直接结合模板，需与转录因不能直接结合模板，需与转录因子子(TF)(TF)结合后才能结合模板。结合后才能结合模板。起始过程比原核生物复杂。起始过程比原核生物复杂。真核生物中不同的真核生物中不同的RNA pol需要不同的基本需要不同的基本转录因子（转录因子（TF）配合完成转录的起始和延）配合完成转录的起始和延长。相对应于长。相对应于RNA pol I、RNA pol II、

9、RNA pol III，这些，这些TF分别称为分别称为TFI、TFII、TFIII。转录起始点转录起始点TATA盒盒CAAT盒盒GC盒盒 增强子增强子顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element)转录起始前的上游区段转录起始前的上游区段 AATAAA切离加尾切离加尾 转录终止点转录终止点 修饰点修饰点 外显子外显子 翻译起始点翻译起始点内内含含子子 OCT-1 OCT-1：ATTTGCAT八聚体八聚体 由由TFIID中的中的TBP识别识别TATA盒，盒，并在并在TAFs的协助下结合的协助下结合到启动子区，然后到启动子区，然后TFIIB与与TBP结合，同时结合，同时TFIIB也

10、能与也能与DNA结合，结合，TFIIA可以稳定与可以稳定与DNA结合的结合的TFIIB-TBP复复合体；合体；TFIIB-TBP复合体与复合体与RNA pol II-TFIIF复合体结合，此举复合体结合，此举可降低可降低RNA pol II 与与DNA的非特异部位的结合，协助的非特异部位的结合，协助RNA pol II 靶向结合启动子；靶向结合启动子；TFIIE和和TFIIH加入，形成闭合复合体，装配完成。加入，形成闭合复合体，装配完成。真核真核RNA聚合酶聚合酶与通用转录因子的作用过程与通用转录因子的作用过程 大肠杆菌的转录泡局部结构示意大肠杆菌的转录泡局部结构示意转录空泡转录空泡(tran

11、scription bubble)：RNA-pol（核心酶）（核心酶）DNA RNA5 3 DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体核糖体RNARNA聚合酶聚合酶真核生物转录延长过程与原核生物大致相似。真核生物转录延长过程与原核生物大致相似。有核膜相隔，有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。没有转录与翻译同步的现象。依赖依赖Rho()因子的转录终止因子的转录终止非依赖非依赖Rho因子的转录终止因子的转录终止（一）原核生物的转录终止（一）原核生物的转录终止指指RNA聚合酶在聚合酶在DNA模板上停顿下来不模板上停顿下来不再前进，转录产物再前进，转录产物RNA链从转录

12、复合物上脱链从转录复合物上脱落下来。落下来。分类分类三、转录的终止三、转录的终止依赖依赖Rho终止转录的终止转录的RNA产物产物3末端含有丰富的末端含有丰富的C（红色红色标出部分标出部分），或者有规律地出现），或者有规律地出现C碱基。碱基。Rho可以结合此区段发挥可以结合此区段发挥ATP酶和解螺旋酶的作用。酶和解螺旋酶的作用。原核细胞转录终止原核细胞转录终止因子，是由六个亚基构成的蛋白质，分子量六个亚基构成的蛋白质，分子量46kD。（。（1）具有结合具有结合RNA的能力（的能力（2）有有ATP酶和解螺旋酶的活性。当转录产物的酶和解螺旋酶的活性。当转录产物的3末端末端含有丰富的含有丰富的C（或有

13、规律地出现）时，就会与（或有规律地出现）时，就会与结合使二者都发生构象的变化，结合使二者都发生构象的变化，从而使从而使RNA聚合酶停顿。解螺旋酶活性使聚合酶停顿。解螺旋酶活性使DNA-RNA杂化链分开释放杂化链分开释放RNA产物，产物，转录终止。转录终止。5 pppG5 3 3 5 RNA-pol茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 发夹结构改变发夹结构改变RNA聚合酶构象，使酶停止移动；聚合酶构象，使酶停止移动；DNA、RNA各自形成自身双链使杂交体不稳定而分离；各自形成自身双链使杂交体不稳定而分离；3 端一连串端一连串U，U=A配对最不稳定，易从模板上脱落。配对最不稳定，易从模

14、板上脱落。转录与复制相同点转录与复制相同点u模板模板都为都为DNADNAu都需依赖都需依赖DNADNA的的聚合酶聚合酶u都形成都形成磷酸二酯键磷酸二酯键u方向都为方向都为5 533u都遵循都遵循碱基互补配对原则碱基互补配对原则转录与复制不同点转录与复制不同点真核生物的转录后加工真核生物的转录后加工Post-transcriptional Modification第三节第三节 一、一、mRNA的转录后加工的转录后加工RNA-polRNA-pol的转录产物，前体为核内不均一的转录产物，前体为核内不均一RNARNA（hnRNAhnRNA）。）。1 1、mRNAmRNA前体前体5 端帽子的形成端帽子的

15、形成 5 端端帽子结构帽子结构(m7GpppGp)u帽子结构帽子结构5 pppG5 GpppGppppG ppi鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶甲基转移酶SAM帽帽子子结结构构的的生生成成5 ppG磷酸酶磷酸酶 Pi加入加入polyApolyA切去切去3 3端过剩碱基端过剩碱基（核酸外切酶）（核酸外切酶）2、mRNAmRNA前体前体3 端加上端加上polyA尾巴尾巴(poly A tail)功能：功能：增加增加mRNA的的稳定性，稳定性，mRNA的转的转运，是核糖体的识别运，是核糖体的识别信号，调控基因表达。信号，调控基因表达。应用：反转录、分离应用：反转录、分离纯化纯化

16、mRNA在细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比在在细胞核内出现的初级转录物的分子量往往比在胞质内出现的成熟胞质内出现的成熟mRNA大几倍，甚至数十倍。核酸序大几倍，甚至数十倍。核酸序列分析证明，列分析证明，mRNA来自来自hnRNA，而，而hnRNA和和DNA模模板链可以完全配对板链可以完全配对 去除初级转录物上的内含子，把外显子连接为成熟去除初级转录物上的内含子，把外显子连接为成熟RNA的过程称为的过程称为mRNA剪接（剪接（mRNA splicing）。3、mRNA前体的拼接前体的拼接外显子外显子内含子内含子DNAmRNA转录转录形成套索形成套索RNA，外显子靠近，外显子靠近剪接体剪接体

17、去除套索去除套索RNA，外显子连接，外显子连接成熟成熟mRNA真核生物的结构基因由若干编码区（外显真核生物的结构基因由若干编码区（外显子）和非编码区（内含子）互相隔开又连续镶子）和非编码区（内含子）互相隔开又连续镶嵌而成，为一个由连续氨基酸组成的蛋白质编嵌而成，为一个由连续氨基酸组成的蛋白质编码码。断裂基因断裂基因(splite gene)CABD编码区编码区 A、B、C、D非编码区非编码区外显子外显子(exon)和内含子和内含子(intron)外显子：外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟现，并表达为成熟RNA的核酸序列。的核酸序列。内含子：内含

18、子：隔断基因的线性表达而在剪接过程隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。中被除去的核酸序列。鸡卵清蛋白成熟鸡卵清蛋白成熟mRNA与与DNA杂交电镜图杂交电镜图DNAmRNA鸡卵清蛋白鸡卵清蛋白基因基因hnRNA首、尾修饰首、尾修饰hnRNA剪接剪接成熟的成熟的mRNA鸡鸡卵卵清清蛋蛋白白基基因因及及其其转转录、录、转转录录后后修修饰饰内含子形成套索内含子形成套索RNA被剪除被剪除 剪接首先涉及套索剪接首先涉及套索RNA（lariat RNA）的形成，即内含子）的形成，即内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子互相靠近而利于剪接。区段弯曲，使相邻的两个外显子互相靠近而利于剪接。此后，还发现

19、内含子近此后，还发现内含子近3端的嘌呤甲基化，例如端的嘌呤甲基化，例如3mG是形是形成套索所必需的。成套索所必需的。内含子在剪接接口处剪除内含子在剪接接口处剪除 大多数内含子都以大多数内含子都以GU为为5 端的起始，而其末端则为端的起始，而其末端则为AG-OH-3。5 GUAG-OH-3 称为剪接接口（称为剪接接口（splicing junction）或）或边界序列。边界序列。剪接后，剪接后，GU或或AG不一定被剪除。不一定被剪除。剪接过程需两次转酯反应剪接过程需两次转酯反应 前体前体mRNA分子有剪切和剪接两种模式分子有剪切和剪接两种模式 前体前体mRNA分子的加工除上述剪接外，还有一分子的

20、加工除上述剪接外，还有一种剪切（种剪切（cleavage）模式。）模式。剪切剪切指的是剪去某些内含子后，在上游的外显指的是剪去某些内含子后，在上游的外显子子3-端直接进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外端直接进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外显子之间的连接反应。显子之间的连接反应。剪接剪接是指剪切后又将相邻的外显子片段连接起是指剪切后又将相邻的外显子片段连接起来，然后进行多聚腺苷酸化。来，然后进行多聚腺苷酸化。前体前体mRNA分子可发生可变剪接分子可发生可变剪接 许多前体许多前体mRNA分子经过加工只产生一种成分子经过加工只产生一种成熟的熟的mRNA，翻译成相应的一种多肽；有些则可，翻译成相应的一种多肽

21、；有些则可剪切或（和）剪接加工成结构有所不同的剪切或（和）剪接加工成结构有所不同的mRNA，这一现象称为这一现象称为可变剪接可变剪接（alternative splicing），），又称又称选择性剪接选择性剪接。真核细胞基因的前体真核细胞基因的前体mRNA交替加工的两种机制交替加工的两种机制 大鼠降钙素基因转录本的可变剪接大鼠降钙素基因转录本的可变剪接 5S rRNA由由RNA聚合酶聚合酶III催化，催化，在核质中转录后无需加工即进入核仁在核质中转录后无需加工即进入核仁二、二、rRNA的转录后加工的转录后加工（1）、被）、被RNase III和和RNase E等剪切成一等剪切成一定链长的定链长

22、的rRNA分子。分子。（2）、在修饰酶催化下进行碱基修饰。）、在修饰酶催化下进行碱基修饰。（3）、与蛋白质结合形成核糖体的大小亚）、与蛋白质结合形成核糖体的大小亚基。基。二、二、tRNA的转录后加工的转录后加工tRNA前体前体RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNARNaseP内切酶内切酶tRNA核苷酸核苷酸转移酶、连接酶转移酶、连接酶ATPADP碱基修饰碱基修饰（2）还原反应）还原反应 如：如：U DHU （3）核苷内的转位反应）核苷内的转位反应 如：如：U （4）脱氨反应）脱氨反应 如：如：A I 如：如：A Am（1）甲基化）甲基化（1 1）（1 1）（3 3）（2 2）（4 4）RNA编辑作用说明，基因的编码序列经编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的。过转录后加工，是可有多用途分化的。四、四、mRNA的编辑的编辑是对是对RNA进行改编的过程包括在进行改编的过程包括在RNA前体前体分子中插入、剔除或置换一些核苷酸残基分子中插入、剔除或置换一些核苷酸残基人类人类apo B基因基因 mRNA（14500个核苷酸）个核苷酸）肝脏肝脏apo B100（4536AA）肠道细胞肠道细胞apo B48（2152AA）mRNA编辑编辑第第2153位密码子位密码子CAAUAA