甜樱桃果实着色与花青苷定性定量测定课件.ppt

1、甜樱桃果实着色与花青苷甜樱桃果实着色与花青苷UPLC-MS/MS定性定量测定定性定量测定汇报人：魏海蓉汇报人：魏海蓉单位：山东省果树研究所单位：山东省果树研究所u甜樱桃果实色泽艳丽，多样！40元元/kg10元元/kgl色泽决定商品价值！l适应性强、品质优良的红色品适应性强、品质优良的红色品种的选育成为甜樱桃育种的重种的选育成为甜樱桃育种的重要方向。要方向。花青苷？花青苷？l果实主要色素成分为叶绿素、类胡萝卜素和花青苷果实主要色素成分为叶绿素、类胡萝卜素和花青苷l果实色泽由三种色素的含量与比例所决定果实色泽由三种色素的含量与比例所决定 012345620d27d34d41d48d55d叶绿素含量

2、叶绿素含量Chlorophyll Content（mg100g-1 FW)花后天数花后天数 Days after flowering（d）13-33美早00.20.40.60.811.21.41.61.8220d27d34d41d48d55d类胡萝卜素含量类胡萝卜素含量Carotenoid Content（mg100g-1 FW)花后天数花后天数 Days after flowering（d）13-33美早图图 1 不同色泽甜樱桃果实发育期间叶绿素和类胡萝卜素含量变化不同色泽甜樱桃果实发育期间叶绿素和类胡萝卜素含量变化1 1 甜樱桃果实发育期间主要色素含量变化甜樱桃果实发育期间主要色素含量变化

3、1.1 叶绿素和类胡萝卜素含量变化叶绿素和类胡萝卜素含量变化增长约增长约300300倍！倍！1.2 花青苷含量变化花青苷含量变化图图2 不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷含量变化不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷含量变化2 2 甜樱桃果实花青苷甜樱桃果实花青苷UPLC-MS/MSUPLC-MS/MS定性定量测定定性定量测定l目前为止，自然界中已经发现了目前为止，自然界中已经发现了600600多种花青苷类物多种花青苷类物质。质。l植物中主要含有芍药色素、花葵素类、矢车菊素、花植物中主要含有芍药色素、花葵素类、矢车菊素、花翠素、牵牛花素、锦葵色素等翠素、牵牛花素、锦葵色素等 6 6 种花青素类型种花青

4、素类型l关于花青苷的检测方法，目前常用紫外可见分光光度关于花青苷的检测方法，目前常用紫外可见分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。l高效液相色谱串联质谱法相比较其它方法在快速分离高效液相色谱串联质谱法相比较其它方法在快速分离、准确定性和灵敏度等方面更具有优势。、准确定性和灵敏度等方面更具有优势。2.1 甜樱桃花青苷物质甜樱桃花青苷物质UPLC/MS/MS定性定量检测方定性定量检测方法的建立法的建立图图 3 不同提取溶剂的提取效果不同提取溶剂的提取效果 盐酸与甲醇、乙醇和丙酮组成的酸性提取液的提取效果，整盐酸与甲醇、乙醇和丙酮组成的酸性提取液的提取效

5、果，整体好于甲酸和乙酸与三种有机溶剂的酸性提取液。其中，体好于甲酸和乙酸与三种有机溶剂的酸性提取液。其中，0.1%盐盐酸甲醇效果最好。酸甲醇效果最好。2.1.1 提取溶剂的选择提取溶剂的选择2.1.2 净化条件的优化净化条件的优化 综合分析综合分析3种大孔树脂的吸附和解吸效果，选择种大孔树脂的吸附和解吸效果，选择AB-8 作为花青苷的净化吸附剂。作为花青苷的净化吸附剂。表表 1 种大孔树脂对花青苷的吸附和解吸效果比较种大孔树脂对花青苷的吸附和解吸效果比较树脂类型Types of resin比表面积Specific surface area（m2-1）平均孔径Average pore size(

6、m)吸附率Adosorption rate(%)解吸率Desorption rate(%)AB-8480-520130-14081.48%73.58%HPD-100A650-70095-10062.76%74.30%HPD-450A50090-10077.36%62.34%2.1.3 色谱条件的优化色谱条件的优化 甲醇的分离度优于乙腈，甲醇的分离度优于乙腈，0.1%甲酸水溶液优于水。甲酸水溶液优于水。0.1%甲酸甲酸水溶液中加入水溶液中加入5 mmol/L甲酸铵后，峰形得到明显改善，灵敏度提甲酸铵后，峰形得到明显改善，灵敏度提高。高。A图图4 7种花青苷的总离子流图种花青苷的总离子流图2.1.

7、4 质谱条件的优化质谱条件的优化化合物名称Compounds分子量Molecular weight保留时间Retention time(min)母离子Precursor ion（m/z）子离子Daughter ion(m/z)解簇电压Declustering Potential/V碰撞能Collision Energy/eV出口电压Collision Cell Exit Potential/eV矢车菊素-3-芸香糖苷Cyanidin-3-rutinoside6312.83595.2287.1*/241.1/269.14042.0/93.0/85.09矢车菊素-3-葡萄糖苷Cyanidin-3-

8、glucoside484.842.75449.2287.1*/213.1/137.04032.0/93.0/70.09芍药素-3-葡萄糖苷Peonidin-3-glucoside498.93.03463.3301.1*/341.9/430.14032.1/31.8/23.18芍药素-3-芸香糖苷Peonidin-3-rutinoside645.013.08609.2301.1*/463.2/286.14040.7/30.0/75.08天竺葵素-3-芸香糖苷Pelargonidin-3-rutinoside614.983.01579.2271.1*/433.2/121.14235.1/26.5/

9、70.08矢车菊素-3-木糖苷Cyanidin-3-xyloside545.812.85419.2287.0*/137.0/269.04040.0/80.0/85.08飞燕草素-3-葡萄糖苷Delphinidin-3-glucoside500.82.48465.1303.1*/229.1/153.14020.0/43.8/80.08表表2 MRM监测模式下监测模式下7种花青苷类物质的质谱优化条件种花青苷类物质的质谱优化条件 电喷雾正离子模式下，对毛细管电压、锥孔电压、脱电喷雾正离子模式下，对毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂温度、脱溶剂气和锥孔气等质谱参数进行优化。溶剂温度、脱溶剂气和锥孔气等质谱参

10、数进行优化。A ABCDEFG图图5 7种花青苷种花青苷(10ug/L)的选择离子谱图的选择离子谱图化合物Compounds线性方程Linear equations相关系数Correlation coefficients(r2)检出限Limits of detection(g/kg)定量限Limits of quantification(g/kg)矢车菊素-3-芸香糖苷Cyanidin-3-rutinosidey=31040 x-550570.99810.140.46矢车菊素-3-葡萄糖苷Cyanidin-3-glucosidey=30419x-524440.99870.180.59芍药素-3

11、-葡萄糖苷Peonidin-3-glucosidey=60975x-3354790.99930.080.26芍药素-3-芸香糖苷Peonidin-3-rutinosidey=27672x-390080.99820.130.43天竺葵素-3-芸香糖苷Pelargonidin-3-rutinosidey=35250 x-5141.10.9990.140.46矢车菊素-3-木糖苷Cyanidin-3-sophorosidey=30679x-1717640.99640.431.42飞燕草素-3-葡萄糖苷Delphinidin 3-glucosidey=29489x-397350.99890.110.3

12、52.1.5 线性范围、检出限和定量限线性范围、检出限和定量限表表3 7种化合物的线性方程相关系数检出限和定量限种化合物的线性方程相关系数检出限和定量限 7种化合物的线性相关系数（种化合物的线性相关系数（r2）为）为0.9964-0.9993，各，各化合物在化合物在0-100ng/ml的范围内线性关系良好，能满足检测的范围内线性关系良好，能满足检测需求。需求。2.1.6 加标回收率和相对标准偏差加标回收率和相对标准偏差 7种花青苷类物质的加标回收率为种花青苷类物质的加标回收率为97.23%-105.37%，相对标准，相对标准偏差（偏差（RSD）为）为1.9%-5.8%，说明本方法重复性好，准确

13、度高，符，说明本方法重复性好，准确度高，符合检测要求。合检测要求。表表 4 甜樱桃果实中甜樱桃果实中7种花青苷类物质的回收率和相对标准偏差种花青苷类物质的回收率和相对标准偏差化合物名称Compounds背景值Back ground（mg/L）加标量Spiking levels（mg/L）平均回收率Average recovery（%）相对标准偏差（%）Relative standard deviation(RSD)矢车菊素-3-芸香糖苷Cyanidin-3-rutinoside3720100.32.640105.03.46097.81.9矢车菊素-3-葡萄糖苷Cyanidin-3-glucos

14、ide11.65105.03.11098.93.315102.65.3芍药素-3-葡萄糖苷Peonidin-3-glucoside0.050.03100.05.60.05104.13.40.1105.22.9芍药素-3-芸香糖苷Peonidin-3-rutinoside0.7420.5104.04.10.798.75.81.099.03.4天竺葵素-3-芸香糖苷Pelargonidin-3-rutinoside1.71.097.22.11.5101.82.92.0103.22.3矢车菊素-3-木糖苷Cyanidin-3-sophoroside0.2190.1104.82.30.2101.13.

15、50.397.52.2飞燕草素-3-葡萄糖苷Delphinidin 3-glucoside0.1930.1105.43.10.299.33.50.398.73.32.2 不同色泽甜樱桃花青苷组分的不同色泽甜樱桃花青苷组分的UPLC-MS/MS分析分析品种Cultivar发育阶段Developmental stage花青苷类物质（mg100g-1）Anthocyanins矢车菊素-3-芸香糖苷Cyanidin-3-rutinoside矢车菊素-3-葡萄糖苷Cyanidin-3-glucoside矢车菊素-3-木糖苷Cyanidin 3-Xyloside飞燕草素-3-葡萄糖苷Delphinidin

16、 3-glucoside芍药素-3-葡萄糖苷Peonidin-3-glucoside芍药素-3-芸香糖苷Peonidin-3-rutinoside天竺葵素-3-芸香糖苷Pelargonidin-3-rutinoside美早Tieton20DAF0.123.090.060.62ND0.56ND35DAF26.209.460.070.390.750.620.0145DAF66.8039.860.231.170.690.951.5055DAF74.0058.250.441.401.011.483.4013-3320DAF0.125.460.140.49NDNDND35DAF0.291.490.100

17、.25NDNDND45DAF0.520.750.110.24NDNDND55DAF0.330.500.070.15NDNDND表表5 不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷类物质的含量不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷类物质的含量 美早美早中检测出中检测出7种花青苷类物质，种花青苷类物质，13-33中仅检测出中仅检测出4种花青苷种花青苷类物质。其中矢车菊素类物质。其中矢车菊素-3-木糖苷和飞燕草素木糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷在甜樱桃葡萄糖苷在甜樱桃中属首次检出。中属首次检出。u甜樱桃果实的红色主要是由于花青苷的积累甜樱桃果实的红色主要是由于花青苷的积累的结果。的结果。u本实验本实验美早美早中的花青苷

18、总量在果实着色中的花青苷总量在果实着色期后迅速升高，期后迅速升高，13-33 变化不明显，并且一变化不明显，并且一直保持在极低含量水平。直保持在极低含量水平。u成熟期成熟期美早美早中花青苷含量显著高于中花青苷含量显著高于13-334 讨论与结论讨论与结论uUPLC-MS/MS可以快速、准确地对甜樱桃果实可以快速、准确地对甜樱桃果实中的花青苷类物质进行定性及定量测定。中的花青苷类物质进行定性及定量测定。u本研究从本研究从美早美早中检测出中检测出7种花青苷类物质，从种花青苷类物质，从13-33中仅检测出中仅检测出4种花青苷类物质。可见不同种花青苷类物质。可见不同品种的甜樱桃中花青苷类物质差异非常大。品种的甜樱桃中花青苷类物质差异非常大。u矢车菊素矢车菊素-3-木糖苷和飞燕草素木糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷在甜葡萄糖苷在甜樱桃中属首次发现。樱桃中属首次发现。