EB病毒感染致病机制与实验室检测方法课件.pptx

1、Pathogenic mechanism of EB virus and laboratory detectionEB病毒感染致病机制与实验室检测方法病毒感染致病机制与实验室检测方法解放军总医院第四医学中心（原304医院）病理科康佳蕊目录目录010203EB病毒概述EB病毒感染致病机制EB病毒检测方法01EB病毒概述病毒概述EB virus overview01.EB病毒的发现病毒的发现EB病毒概述病毒概述Denis Parsons Burkitt患伯基特淋巴瘤的非洲男童1958年发表的论文EB病毒病毒。1964年，利用电子显微镜电子显微镜在伯基特淋巴瘤的活检组织细胞中，观察到一种类似疱疹病毒

2、颗粒的新病毒，并将其命名为“非洲儿童下颌角肉瘤”中，首次首次系统性的描述了伯基特淋巴瘤伯基特淋巴瘤。人类疱疹病毒人类疱疹病毒型别型别名称名称亚科亚科潜伏细胞潜伏细胞/组织组织1单纯疱疹病毒1型（HSV-1）神经元细胞2单纯疱疹病毒2型（HSV-2）神经元细胞345水痘带状疱疹病毒（VSV）Epstein-Barr病毒（病毒（EBV）巨细胞病毒（CMV）神经元细胞B淋巴细胞淋巴细胞单核巨噬细胞/淋巴细胞6人类疱疹病毒6型（HHV-6）淋巴组织7人类疱疹病毒7型（HHV-7）淋巴组织8人类疱疹病毒8型（HHV-8）02.EB病毒属性病毒属性EB病毒概述病毒概述03.EB病毒的结构病毒的结构EB病毒

3、概述病毒概述a形态结构形态结构 成熟的病毒颗粒呈球形，直径150-180nm 蛋白囊膜 核衣壳，二十面体对称，62个管状粒子组成 核样物，直径5nmb基因组结构基因组结构 线性双链DNA分子，大小175kb EBV（175kb）是HBV（3kb）的58.3倍c编码蛋白编码蛋白 衣壳抗原（VCA）、早期抗原（EA）、核心抗原（EBNA）潜伏膜蛋白（LMP-1、LMP-2）小RNA（EBER）04.流行病学研究流行病学研究EB病毒概述病毒概述ab地域分布地域分布 世界性，分布广泛 散发性，四季皆可传染源传染源 病毒携带者 患者cd传播途径传播途径 飞沫传播，“接吻病”血液传播或性传播易感人群易感人

4、群 不论种族、性别，20岁以下女性略多 感染率高，大多呈潜伏状态02EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制Pathogenic mechanism of EB virus infection01.上皮细胞感染方式上皮细胞感染方式EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制BMRF-21整合素gH/gLav5/6/8EBV上皮细胞上皮细胞融合融合+abgB（CendR）+NRP1cB细胞与上皮细胞接触细胞与上皮细胞接触BMRF-2+1整合素整合素02.B细胞感染方式细胞感染方式EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制EBVB淋巴细胞淋巴细胞内吞内吞入核入核gp350/220+CD21gp42+HLA-II类分

5、子潜伏性感染潜伏性感染多见于EBV相关的恶性肿瘤DNA呈线性滚动复制DNA环形附加体不发生复制VCA、EA充分表达EBNAs、LMPs、EBERs表达升高病毒完成装配宿主细胞死亡随宿主细胞复制宿主细胞永生化增值性感染增值性感染多见于EBV相关感染性疾病03.免疫逃逸机制免疫逃逸机制EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制0605020301干扰抗原加工和提呈干扰细胞因子作用04抑制宿主细胞凋亡抑制Th1免疫应答调节CTL免疫应答潜伏期EBV基因表达下调EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制04.EB病毒参与肿瘤发生发展的分子机制病毒参与肿瘤发生发展的分子机制LMP-1的抗凋亡作用的抗凋亡作用LMP-

6、1Bcl-2,Mcl-1,A20p53依赖的细胞凋亡LMP-1(CTAR)JNKAP-1增殖分化，侵袭转移TRAFs/TRADDNF-Bp38/MAPKATF2凋亡EB病毒感染致病机制病毒感染致病机制LMP-2A参与的抑癌基因参与的抑癌基因CpG岛甲基化岛甲基化LMP-2ASTAT3DNMT-1,3A,3BPTEN,p16,p73CpG岛甲基化PTEN,p16,p73表达04.EB病毒参与肿瘤发生发展的分子机制病毒参与肿瘤发生发展的分子机制EBNA-1的抗凋亡作用的抗凋亡作用EBER的诱导作用的诱导作用EBER(RIG-I)+TLR-3Survivin触发信号转导诱导相邻细胞产生生物学变化EB

7、NA-1+Sp1凋亡侵袭转移03EB病毒检测方法病毒检测方法EB virus detection method00.检测方法概述检测方法概述EB病毒检测方法病毒检测方法03050201电镜检测免疫组化基因测序 06脱落细胞检测04原位杂交血液检测01.血液检测（血液检测（1/3）EB病毒检测方法病毒检测方法bac目的基因或蛋白目的基因或蛋白 核酸载量 VCA、EA、EBNA相关抗体标本来源标本来源血浆、血清检测方法检测方法嗜异凝集抗体检测外周血异型淋巴细胞比例RT-PCR检测EBV核酸载量EBV特异性抗体与特异性抗体与VCA-IgG亲和力联合检测亲和力联合检测VCA-IgGVCA-IgMEA-

8、IgGEBNA-IgGVCA-IgG亲和力亲和力感染时期感染时期未感染EBV/低早期/高恢复期高既往感染/高复发感染01.血液检测（血液检测（2/3）机体感染机体感染EBV后抗体水平变化后抗体水平变化EB病毒检测方法病毒检测方法VCA-IgG亲合力检测联合多抗体检测对亲合力检测联合多抗体检测对EBV感染时期的解释感染时期的解释优点优点不足不足01.血液检测（血液检测（3/3）血液血液检测检测EB病毒检测方法病毒检测方法 微创 临床指标 动态监测 定量分析 非定位性 无组织细胞特异性 难以成为病理诊断直接证据02.脱落细胞检测脱落细胞检测EB病毒检测方法病毒检测方法bac标本来源标本来源 唾液、

9、口腔含漱液 咽喉拭子、鼻咽拭子检测方法检测方法目的基因目的基因LMP-1基因RT-PCREB病毒检测方法病毒检测方法优点优点不足不足02.脱落细胞检测脱落细胞检测脱落脱落细胞细胞检测检测 取材方便 无创 早期筛查 流行病学调查 稳定性、特异性低 参考价值有限03.免疫组化（免疫组化（1/3）EB病毒检测方法病毒检测方法abc标本来源标本来源石蜡包埋组织目的蛋白目的蛋白LMP-1，LMP-2检测原理检测原理 抗原抗体特异性结合 化学显色原理03.免疫组化（免疫组化（2/3）EB病毒检测方法病毒检测方法NK/T-LMP1NSCHL-LMP1LPM1不同疾病免疫组化检测结果de检测流程检测流程 传统

10、手工染色 免疫组化仪全自动染色结果观察结果观察胞膜及胞浆阳性03.免疫组化（免疫组化（3/3）EB病毒检测方法病毒检测方法优点优点不足不足 简便易行 成本较低 细胞定位免疫免疫组化组化 阳性率低 稳定性、特异性低 易出现假阴性 病理诊断参考价值不高类型类型EBNA1EBNA2-6LMP-1LMP-2EBER细胞细胞/疾病疾病潜伏BL细胞株伯基特淋巴瘤胃癌潜伏BL细胞株鼻咽癌霍奇金淋巴瘤NK/T细胞淋巴瘤潜伏LCL传染性单核细胞增多症免疫缺陷相关B淋巴瘤X染色体相关淋巴增生疾病潜伏/健康携带者血中B细胞04.原位杂交（原位杂交（EBER）（）（1/4）EB病毒检测方法病毒检测方法abc标本来源标

11、本来源石蜡包埋组织目的基因目的基因EBER检测原理检测原理碱基互补，单链DNA探针原位杂交，检测EB病毒RNA片段EBV相关疾病潜伏感染类型及基因表达相关疾病潜伏感染类型及基因表达EB病毒检测方法病毒检测方法EBER全自动检测优势 高效省时 自动化、标准化 节省人力 试剂覆盖均匀 孵育环境可控 降低脱片率 减少废液量04.原位杂交（原位杂交（EBER）（）（2/4）手工操作注意事项 RNA酶污染 试剂的配制 烤片温度及时间适宜 前处理：脱蜡及干燥 酶消化时间及温度 加盖玻片避免气泡 孵育过程避免试剂蒸发 充分洗涤均需设有阳性及阴性对照均需设有阳性及阴性对照04.原位杂交（原位杂交（EBER）（

12、）（3/4）AILT-EBEREBEREBER-LMP1双染双染EB病毒检测方法病毒检测方法cHL-EBEREBER-CD20双染双染EB病毒检测方法病毒检测方法 细胞形态保持较好 细胞定位准确：细胞核，少数细胞浆亦着色 稳定性好、特异性高 对病理诊断重要的参考价值 组织和细胞中EBV检测的金标准 对操作者的熟练和规范程度要求高 不适合EBV感染的筛查04.原位杂交（原位杂交（EBER）（）（4/4）优点优点原位原位杂交杂交不足不足05.电镜检测（电镜检测（1/6）EB病毒检测方法病毒检测方法ac标本来源标本来源新鲜组织、石蜡包埋组织检测原理检测原理重金属盐对组织结构的染色程度不同而产生不同的

13、散射强度，在电镜下表现为不同bd检测目的检测目的镜下直观病毒样颗粒结果观察结果观察 圆形 直径100nm300nm 外层有双层结构的包膜的明暗反差电镜检测在电镜检测在EBV病毒发现过程中具有重要作用病毒发现过程中具有重要作用05.电镜检测（电镜检测（2/6）EB病毒检测方法病毒检测方法电镜样本制作流程电镜样本制作流程光镜样本制作流程光镜样本制作流程1mm3取材取材2cm1.5cm厚度3mm戊二醛锇酸固定固定福尔马林酒精丙酮脱水脱水酒精环氧丙烷树脂浸透浸透包埋包埋二甲苯石蜡50-80nm切片切片3-4m醋酸铀柠檬酸铅染色染色苏木素伊红EB病毒检测方法病毒检测方法电镜检查在发现电镜检查在发现EBV

14、病毒中具有重要作用病毒中具有重要作用EBER05.电镜检测（电镜检测（3/6）NK/T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤EB病毒检测方法病毒检测方法EBER05.电镜检测（电镜检测（4/6）鼻咽鳞癌鼻咽鳞癌EB病毒检测方法病毒检测方法EBER05.电镜检测（电镜检测（5/6）EBV阳性阳性DLBCLEB病毒检测方法病毒检测方法优点优点不足不足05.电镜检测（电镜检测（6/6）电镜电镜检测检测 亚细胞定位准确 相对定量 稳定性、特异性极高 形态学证据 成本较高 耗时长 偏重于科研应用06.基因测序（基因测序（1/8）EB病毒检测方法病毒检测方法四四种种富富集集方方式式06.基因测序（基因测序（2/8）EB病毒

15、检测方法病毒检测方法EB病毒检测方法病毒检测方法06.基因测序（基因测序（3/8）Sanger测序测序基因组技术特点 B95-8（第一个被完整测序的EBV株系）GD1（广东1型）AG876（第一个完整的2型EBV基因组）宿主基因组的干扰 拼接组装困难 低通量EB病毒检测方法病毒检测方法06.基因测序（基因测序（4/8）直接直接NGS测序测序基因组技术特点 GD2（首个使用NGS获得其基因组序列的EBV亚型）C666-1（鼻咽癌EBV细胞系）其余26种基因型 高通量，速度快，灵敏度高，程序自动化 读长较短 无法排除宿主基因组DNA的干扰富集方法富集方法基因组基因组技术特点技术特点诱导复制技术Ak

16、ataMutu诱导病毒裂解复制IgM/IgG筛选特定细胞系PCR富集技术HKNPC1LCL1，3，9，10设计多组引物偏向性特异性不高F因子克隆技术M81大肠埃希菌F因子Sanger确定重复区域杂交捕获技术HKNPC2-9EBVaGC1-971EBVHN1-18LC1-4RNA探针单链DNA探针双链DNA探针EB病毒检测方法病毒检测方法06.基因测序（基因测序（5/8）EBV富集富集+NGS测序测序06.基因测序（基因测序（6/8）EB病毒检测方法病毒检测方法生物信息学分析生物信息学分析 与已有的基因组序列作参考比对 BWT算法 技术特点：a)找寻序列的相似性和同源性b)受编辑距离限制c)错配

17、发生频率高d)同源基因的干扰（BHRF-BCL2，BCLF-IL10），序列匹配序列匹配从头组装从头组装06.基因测序（基因测序（7/8）EB病毒检测方法病毒检测方法生物信息学分析生物信息学分析 不借助外部数据，对新基因组的测序 发现EBV变异体、地域分布规律意义重大 技术特点：a)高质量的读取b)低质量读取数据的去除c)高均一性的覆盖序列匹配序列匹配从头组装从头组装EB病毒检测方法病毒检测方法优点优点不足不足06.基因测序（基因测序（8/8）基因基因测序测序 通量大 研究应用 病毒株、亚型的筛选 疫苗的设计研制 价格高、时间长 难于应用临床检测07.检测方法总结检测方法总结EB病毒检测方法病毒检测方法检测方法检测方法血液检测脱落细胞检测免疫组化原位杂交电镜检测基因测序技术优势技术优势动态监测无创筛查辅助诊断诊断金标准形态学证据科研大数据THANK YOU感谢聆听，批评指导