《细胞工程》第6章:细胞拆合与克隆技术课件.ppt
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1、细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程Cell Engineering细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术Chapter 6Chapter 6、细胞拆合与克隆技术、细胞拆合与克隆技术61 细胞拆合细胞拆合611 细胞拆合技术发展概况细胞拆合技术发展概况612 细胞拆合概念与意义细胞拆合概念与意义 613 细胞拆合技术与关键细胞拆合技术与关键62 克隆技术克隆技术621 克隆的定义及理论基础克隆的定义及理论基础622 细胞核移植(也是克隆技术关键)细胞核移植(也是克隆技术关键)623 克隆动物一般制备技术克隆动物一般制备技术624 体细胞克隆技术体细胞克隆技术625 克隆技术的应用与意义克隆技
2、术的应用与意义626 存在的问题存在的问题627 克隆技术发展趋势克隆技术发展趋势细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术61 细胞拆合细胞拆合611 细胞拆合技术发展概况细胞拆合技术发展概况细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术612 细胞拆合概念与意义细胞拆合概念与意义一、细胞拆合(一、细胞拆合(Cell Reconstruction):):是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组是指从活细胞中分离出细胞器及其细胞组分,在体外一定条件下将不同细胞来源的分,在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组形成有生物活性细胞器及其组分进行重组形成有生物活性的细胞或细胞器的一种细胞工程技术。的细胞或细胞
3、器的一种细胞工程技术。细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术二、细胞拆合过程:二、细胞拆合过程:细胞器及其分离细胞器及其分离 同种或异种细胞器与同种或异种细胞器与组分重组组分重组 新的重组细胞或新的性状或产品新的重组细胞或新的性状或产品 细胞核分离、细胞核分离、细胞核细胞核 胞质体的获得胞质体的获得 融合融合 胞质体胞质体细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术三、细胞拆合基本方式(目前)三、细胞拆合基本方式(目前)细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术四、细胞拆合意义四、细胞拆合意义 细胞拆合技术是现代生物工程中令人细胞拆合技术是现代生物工程中令人瞩目的热点课题,细胞拆合与细胞融合瞩目的热点课题,细胞拆合
4、与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段,它与基因转移技术、上主要构建手段,它与基因转移技术、干细胞技术等结合,可以人为地获得新干细胞技术等结合,可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。物种或使细胞表达新的性状和新的产物。细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术613 细胞拆合技术与关键细胞拆合技术与关键一、细胞拆合技术方法一、细胞拆合技术方法细胞组分分离技术细胞组分分离技术分级分离法分级分离法 细胞大小、密度细胞大小、密度密度梯度离心法密度梯度离心法 利用利用 细胞表面电荷细胞表面电荷流式细胞分选仪分离法流式细胞分选仪分离法 细胞表面
5、标志细胞表面标志细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞破碎方法细胞破碎方法 超声波破碎法超声波破碎法反复冻融法:反复冻融法:-70 37C,重复,重复3-4次,次,细胞壁破碎细胞壁破碎化学裂解法:化学裂解法:SDS(十二烷基磺酸钠)(十二烷基磺酸钠)高速组织捣碎法:需循环水冷却高速组织捣碎法:需循环水冷却细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术流式细胞分选仪流式细胞分选仪细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术去核细胞(胞质体)的制备:(见罗立新表去核细胞(胞质体)的制备:(见罗立新表5-1)细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术核体的制备:核体的制备:贴壁法纯化(见图贴壁法纯化(见图5-2、5-3)核体需核
6、体需5-10h再贴壁再贴壁 培养培养 分离分离 完整细胞需完整细胞需2h (菲可液梯度离心)(菲可液梯度离心)细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术微核体的制备:微核体的制备:CB具有排核作用,形成的微核体;具有排核作用,形成的微核体;01ug/mL秋水仙胺,秋水仙胺,48h,处理细胞,处理细胞 细胞微核化细胞微核化 离心离心14000r/min、20min,80-90%1-3%牛血清密度梯度离心牛血清密度梯度离心(见图(见图5-4)细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程第6章:细胞拆合与克隆
7、技术 去核细胞的性质:去核细胞的性质:细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术二、细胞拆合技术关键二、细胞拆合技术关键细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术细胞器与完整细胞融合:细胞器与完整细胞融合:ctDNA叶绿体叶绿体(抗药性、色素)(抗药性、色素)细胞器分离细胞器分离 细胞器包裹细胞器包裹 mtDNA线粒体线粒体 形成脂质体或血影细胞形成脂质体或血影细胞 与完整细胞融合与完整细胞融合生物大分子引入完整细胞:生物大分子引入完整细胞:1975年,童第周、牛满江,鲤鱼或鲫鱼年,童第周、牛满江,鲤鱼或鲫鱼mRNA 鲤金鱼鲤金鱼 金鱼受精卵金鱼受精卵 鲫金鱼鲫金鱼细胞工程第
8、6章:细胞拆合与克隆技术62克隆技术克隆技术621 克隆的定义及理论基础克隆的定义及理论基础一、克隆(一、克隆(clone):):克隆克隆原意为原意为“扦插的枝条扦插的枝条”无性繁殖系无性繁殖系 基因克隆(实为基因扩增)基因克隆(实为基因扩增)细胞克隆(实为有丝分裂的细胞集落)细胞克隆(实为有丝分裂的细胞集落)个体克隆(如植物快繁个体)个体克隆(如植物快繁个体)引伸为引伸为“克隆操作技术,即核移殖技术克隆操作技术,即核移殖技术”细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术二、理论基础:二、理论基础:体细胞具有细胞全能性体细胞具有细胞全能性细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术三、发展历程:三、发展历程:细胞
9、工程第6章:细胞拆合与克隆技术622 细胞核移植(也是克隆技术关键)细胞核移植(也是克隆技术关键)一、定义一、定义 细胞核移植技术:是指利用显微操作技术将细胞核移植技术:是指利用显微操作技术将某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟某种动物细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术;卵内的精细技术;它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植;它可分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植;它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生它可用于发育生物学、细胞生物学、分子生物学等问题的研究,实现不同细胞核与细胞质的物学等问题的研究,实现不同细胞核与细胞质的组配,还能培育出新物种。组配,还能培育出新物种。细胞工程
10、第6章:细胞拆合与克隆技术二、发展历程二、发展历程细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术三、核移植技术三、核移植技术供体和受体的准备供体和受体的准备 鱼类:鱼类:供体供体囊胚细胞或成体细胞,囊胚细胞或成体细胞,受体受体成熟的卵细胞成熟的卵细胞 发育发育(人工催产、水中激活)(人工催产、水中激活)时间时间 两栖类:两栖类:配合配合 供体供体囊胚细胞或成体细胞,囊胚细胞或成体细胞,好好 受体受体成熟卵细胞(人工针刺)成熟卵细胞(人工针刺)细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术鸟类、爬行类:未知鸟类、爬行类:未知哺乳类:哺乳类:供体供体早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细早期胚胎细胞、胚胎干细胞、体细 胞;后用体
11、细胞,如乳腺细胞、粘胞;后用体细胞,如乳腺细胞、粘 膜上皮细胞;合子核到膜上皮细胞;合子核到64细胞期,细胞期,0.2%链霉蛋白酶预处理链霉蛋白酶预处理,溶去胚胎溶去胚胎 胶膜及透明带胶膜及透明带,分离单个卵裂球;分离单个卵裂球;受体受体去核卵母细胞、受精卵、去核卵母细胞、受精卵、2细胞胚细胞胚 胎(第一极体成熟时期去核);胎(第一极体成熟时期去核);细胞工程第6章:细胞拆合与克隆技术去卵膜和卵核去卵膜和卵核用玻璃微针(尖为用玻璃微针(尖为2-4um)鱼卵鱼卵借助第二极体标志,去核;借助第二极体标志,去核;两栖卵两栖卵紫外线去核;紫外线去核;哺乳卵哺乳卵借助第一极体;借助第一极体;供体细胞制备
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