分子生物学-课件-分子生物第六章.ppt

1、内容内容 1、核酸提取与鉴定核酸提取与鉴定 2、印迹杂交技术印迹杂交技术 3、聚合酶链反应聚合酶链反应 4、重组重组DNA技术技术 5、转基因技术与基因打靶转基因技术与基因打靶 研究对象研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等第一节第一节 核酸提取核酸提取 总原则：总原则：保证核酸保证核酸一级结构的完整性一级结构的完整性 避免杂质避免杂质污染污染 核酸提取的主要步骤：核酸提取的主要步骤：I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜内容物释放内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V

2、.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸提取过程核酸提取过程一、质粒一、质粒DNA质粒质粒 (Plasmid)(Plasmid)是游离于细菌是游离于细菌 (及个别真核细胞及个别真核细胞)染色体染色体DNADNA之外、能自主复制之外、能自主复制的遗传物质的遗传物质多数是一种闭环多数是一种闭环DNADNA，大小为，大小为1-300kb1-300kb，能够转化细菌，是，能够转化细菌，是基因载体基因载体提取质粒提取质粒DNADNA包括包括三个基本步三个基本步骤骤11培养细菌和扩增质粒培养细菌和扩增质粒 在培养基中加入抑制剂在培养基中加入抑制剂 (例如氯霉素例如氯霉素)可以抑制细可

3、以抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒DNADNA会继续复制，拷贝数可达会继续复制，拷贝数可达30003000个，这一过程称为个，这一过程称为质粒扩增质粒扩增 如果要扩增的质粒如果要扩增的质粒DNADNA携带氯霉素抗性基因携带氯霉素抗性基因 (CmR)(CmR)，可以用可以用壮观霉素替代氯霉素壮观霉素替代氯霉素2收获和裂解细菌收获和裂解细菌 机械法机械法:超声波、玻璃珠等（易引起超声波、玻璃珠等（易引起DNADNA断裂）断裂）化学试剂法化学试剂法:十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 (SDS)(SDS)等等（单用难以充分裂解）（单用难以充分裂解）溶菌

4、酶溶菌酶-化学试剂联合法化学试剂联合法:先用溶菌酶先用溶菌酶消化，再用化学试剂处理（最常用）消化，再用化学试剂处理（最常用）3分离纯化质粒分离纯化质粒 关键：关键：除去染色体除去染色体DNADNA 质粒质粒DNADNA特性：特性：相对相对较小较小（仅为染色体（仅为染色体DNADNA的的0.1%-2%0.1%-2%）闭环闭环（染色体（染色体DNADNA大量断裂并且呈线性结构）大量断裂并且呈线性结构）提取方法：提取方法：氯化铯密度梯度分离法、碱裂解氯化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法法、煮沸裂解法等等（1）氯化铯密度梯度分离法）氯化铯密度梯度分离法EBEB分子可嵌入相邻碱基对之间，使分子可嵌

5、入相邻碱基对之间，使DNADNA解旋解旋开环开环DNADNA或线性或线性DNADNA存在存在游离末端游离末端易于解旋，可结合大易于解旋，可结合大量量EBEB，DNA-EBDNA-EB复合物复合物含含EBEB越多，密度越小越多，密度越小闭环质粒闭环质粒DNADNA没有游离末端，不易解旋，结合少量没有游离末端，不易解旋，结合少量EBEB，密度较大密度较大在饱和在饱和EBEB条件下条件下，质粒，质粒DNADNA密度比断裂染色体密度比断裂染色体DNADNA密度密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNADNA(2)碱裂解法碱裂解法（快速提取质粒（快速提取质

6、粒DNA，收获率高），收获率高）溶液溶液I I(50mmol/L(50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 10mmol/L EDTAEDTA，Ph=80)Ph=80)使菌悬浮使菌悬浮EDTAEDTA整合整合Mg2+Mg2+、Ca2+Ca2+以抑制脱氧核糖核酸酶以抑制脱氧核糖核酸酶 (DNase)(DNase)的活性的活性溶液溶液IIII（200mmol/L NaOH200mmol/L NaOH，1%SDS1%SDS，pH=125)pH=125)：裂解细菌裂解细菌使蛋白质、染色体使蛋白质、染色体DNADNA和质粒和质

7、粒DNADNA变性变性溶液溶液IIIIII(3mol/L(3mol/L醋酸钾，醋酸钾，2mol/L2mol/L醋酸，醋酸，pH=48)pH=48)使变性蛋白质与染色体使变性蛋白质与染色体DNADNA共沉淀共沉淀闭环质粒闭环质粒DNADNA复性复性，留在上清液中，留在上清液中通过离心分离提取通过离心分离提取 (3)煮沸裂解法煮沸裂解法以以溶菌酶、溶菌酶、TritonTriton裂解细菌裂解细菌，然后以，然后以沸水浴沸水浴加热，不加热，不仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNADNA、质、质粒粒DNADNA变性变性当降低温度时，闭环质粒当降低温度时，闭环质

8、粒DNADNA复性留在上清液中，而复性留在上清液中，而染色体染色体DNADNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过离心除去离心除去在离心上清液中加入有机溶剂在离心上清液中加入有机溶剂 (例如异丙醇例如异丙醇)便得到便得到质粒质粒DNADNA粗品沉淀粗品沉淀二、真核生物基因组二、真核生物基因组DNA 液氮冷冻液氮冷冻组织材料，将其组织材料，将其研成细粉研成细粉 用用EDTAEDTA(蟹合蟹合Ca/MgCa/Mg，抑制，抑制DNaseDNase活性活性)、去污剂去污剂(SDS(SDS能溶解能溶解膜蛋白和膜脂，裂解细胞膜和核膜，使膜脂、蛋白质与膜蛋白和膜脂，裂解细

9、胞膜和核膜，使膜脂、蛋白质与DNADNA分离分离)和和蛋白酶蛋白酶K K(丝氨酸蛋白酶，水解由脂肪族、芳香丝氨酸蛋白酶，水解由脂肪族、芳香族氨基酸的竣基形成的肽键族氨基酸的竣基形成的肽键)共同共同裂解细胞裂解细胞 用用苯酚、氯仿苯酚、氯仿/异戊醇异戊醇等抽提等抽提除去蛋白质除去蛋白质(氯仿可以除去氯仿可以除去DNADNA溶液中微量酚的污染，异戊醇可以防止蛋白质变性操溶液中微量酚的污染，异戊醇可以防止蛋白质变性操作过程中产生气泡作过程中产生气泡)经经乙醇乙醇沉淀进一步沉淀进一步纯化纯化，可获得，可获得100-200kb100-200kb的的DNADNA片段片段三、真核生物三、真核生物RNA 最关

10、键的是最关键的是抑制抑制RNARNA酶的活酶的活性性(RNase(RNase无处不在，稳定并无处不在，稳定并且耐高温且耐高温 )提取提取RNARNA所用器皿的处理及溶液的准备所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用使用灭菌的一次性用品。或用0.1%0.1%二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐（DEPCDEPC）水浸泡或用氯仿冲洗）水浸泡或用氯仿冲洗(注意注意:有机玻璃器具因可被氯仿有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀腐蚀,故不能使用氯仿处理故不能使用氯仿处理)玻璃用品：玻璃用品：使用前于使用前于180180的高温下干烤的高温下干烤6h6h以上，或在以上，或在250250下干烤下干

11、烤3h3h以上以上有机玻璃的电泳槽等有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗双蒸水冲洗,乙醇干乙醇干燥燥,再用再用3 3H H2 2O O2 2室温浸泡室温浸泡10min10min，然后用，然后用0.10.1DEPCDEPC水冲洗，晾水冲洗，晾干干 (一一)总总RNA提取提取 1 1、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍-氯化铯密度梯度分离法氯化铯密度梯度分离法 利用利用异硫氰酸胍变性蛋白质，抑制异硫氰酸胍变性蛋白质，抑制RNaseRNase的活性的活性，再进行，再进行密度梯度离心，能够获得密度梯度离心，能够获得高纯度的总高纯度的总RNARNA 适合于从冷冻时间长、细胞核不易分离及富

12、含适合于从冷冻时间长、细胞核不易分离及富含RNaseRNase的组的组织细胞内提取织细胞内提取RNARNA 不适合于一般实验室应用（一次提取量有限，操作过程复不适合于一般实验室应用（一次提取量有限，操作过程复杂费时，需要进行密度梯度离心）杂费时，需要进行密度梯度离心）2、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍-酚氯仿法酚氯仿法 以含以含4mmol/L4mmol/L异硫氰酸胍异硫氰酸胍与与01mmol/L01mmol/L巯基乙醇巯基乙醇的的溶液溶液裂解细胞裂解细胞 在在pH=40pH=40的条件下用的条件下用酚酚/氯仿抽提氯仿抽提裂解溶液裂解溶液 最后通过最后通过异丙醇沉淀异丙醇沉淀与与75%75%的的乙醇洗涤

13、乙醇洗涤来制备来制备RNARNA 比比1 1法简便、经济和高效，能同时处理多个标本，法简便、经济和高效，能同时处理多个标本，且且RNARNA的完整性和纯度都很高的完整性和纯度都很高 3 3、氯化锂、氯化锂-尿素法尿素法 利用利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNARNA酶酶，氯化锂选择性沉淀氯化锂选择性沉淀RNARNA 缺点：存在缺点：存在DNADNA污染，氯化锂沉淀污染，氯化锂沉淀RNARNA会丢失会丢失一些小分子一些小分子RNARNA，如，如5sRNA5sRNA等等 优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大量样品少量组织细胞的量

14、样品少量组织细胞的RNARNA提取提取4热酚法热酚法将将异硫氰酸胍、巯基乙醇和异硫氰酸胍、巯基乙醇和SDSSDS等联合使用，可以快速裂等联合使用，可以快速裂解细胞，解离核蛋白复合物，释放解细胞，解离核蛋白复合物，释放RNARNA，并有效抑制，并有效抑制RNaseRNase的活性的活性用用苯酚苯酚(65)(65)、氯仿、氯仿等有机溶剂抽提，离心除去蛋白质等有机溶剂抽提，离心除去蛋白质和和DNADNA，留在水相中的，留在水相中的RNARNA可以用乙醇或异丙醇反复沉淀、可以用乙醇或异丙醇反复沉淀、纯化纯化该方法操作简便，成本较低，适合于从培养细胞和动物组该方法操作简便，成本较低，适合于从培养细胞和动

15、物组织中提取织中提取RNARNA(二二)mRNA)mRNA提取提取 四、核酸纯度鉴定四、核酸纯度鉴定（一）核酸浓度检测（一）核酸浓度检测 DNADNA和和RNARNA在波长在波长260nm260nm处有很高的吸收峰值，用标处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长准样品测得在波长260nm260nm处，处，A260A2601 1时，样品中时，样品中双链双链DNADNA浓度为浓度为50 g/ml50 g/ml，单链，单链DNADNA或或RNARNA浓度为浓度为40 g/ml40 g/ml，或相当于，或相当于20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 DNA(g/l)=A260DNA(g/l)=A26

16、05050稀释倍数稀释倍数/1000/1000 RNARNA（g/l g/l）=A260=A2604040稀释倍数稀释倍数 /1000/1000根据根据A260/A280A260/A280，A260/A230A260/A230的比值判断核酸样品的纯度的比值判断核酸样品的纯度11纯度较高的纯度较高的DNADNA，A260/A2801.8A260/A2801.8 1818，说明可能含有，说明可能含有RNARNA，或，或DNADNA部分降解部分降解1818，说明可能含有苯酚或蛋白质等，说明可能含有苯酚或蛋白质等22纯度较高的纯度较高的RNARNA，A260/A280=1.8-2.0A260/A280

17、=1.8-2.0 18 18，说明可能含有蛋白质等，说明可能含有蛋白质等 20 20，说明可能有，说明可能有RNARNA降解降解33纯度较高的核酸，纯度较高的核酸，A260/A230A260/A2302020如果比值太小，说明可能含有蛋白质、肽、苯酚或异硫氰如果比值太小，说明可能含有蛋白质、肽、苯酚或异硫氰酸盐等酸盐等（二）核酸纯度检测（二）核酸纯度检测第二节第二节 核酸电泳核酸电泳 根据电泳支持介质分：根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段：多用于鉴定较大核酸片段（0.160kb），特别是分子量测定），特别是分子量测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳

18、：用于分析用于分析RNA或或Mr小于小于1000bp的的DNA片段片段，特别是，特别是DNA测序测序一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳 考虑因素：考虑因素：11凝胶浓度凝胶浓度大的大的DNADNA片段要用低浓度的琼脂糖凝胶。片段要用低浓度的琼脂糖凝胶。2DNA2DNA大小大小迁移率与分子量的对数值呈线性关系迁移率与分子量的对数值呈线性关系3DNA3DNA构型构型(大小相同而构型不同的大小相同而构型不同的DNA)DNA)质粒质粒DNADNA存在三种构型存在三种构型(迁移率不一样迁移率不一样,I,IIIIIIIII)II)I I型：闭环型：闭环DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)，所含的

19、两股，所含的两股DNADNA均成环均成环IIII型：开环型：开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)，一股成环，另一股开链，一股成环，另一股开链IIIIII型：线性型：线性DNA(LDNA)DNA(LDNA)，两股，两股DNADNA均开链均开链用途用途 可以间接分析可以间接分析DNADNA样品的含量和分子量样品的含量和分子量：荧光强度与：荧光强度与DNADNA含含量成正比量成正比(与已知含量和分子量的参照与已知含量和分子量的参照DNADNA平行电泳平行电泳)可以分析可以分析DNADNA样品纯度样品纯度:蛋白质与蛋白质与DNADNA结合，在加样孔内形结合，在加样孔内形成荧光亮点成荧光亮点;R

20、NA;RNA则在则在DNADNA区带前方形成云雾状亮带区带前方形成云雾状亮带 可以分析可以分析RNARNA:控制变性条件是分析控制变性条件是分析RNARNA的关键的关键 确定确定RNARNA在进行变性凝胶电泳过程中是否发生降解在进行变性凝胶电泳过程中是否发生降解：用：用28S(28S(约约4700nt)4700nt)和和18S(18S(约约1900nt)1900nt)两种两种rRNArRNA作为参照：两条作为参照：两条区带的亮度比值应为区带的亮度比值应为28S:18S=2:128S:18S=2:1largemoderate small 基因组基因组DNADNA抽提结果电泳图抽提结果电泳图 总总

21、RNARNA抽提结果电泳图抽提结果电泳图 mRNA琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGEPAGE，是以聚丙烯酰，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质胺凝胶作为支持介质 聚丙烯酰胺凝胶是由单体的聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺丙烯酰胺和和甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成化完成 常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（硫酸铵（

22、APAP）以及以及加速剂加速剂四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED），四甲基乙二胺催，四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。凝胶孔径大小由聚合链化过硫酸铵产生自由基。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定的长度及交联度所决定 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸 非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶 用于分离纯化双链DNA片段 变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于分离和纯化单链DNA片段的。其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大，分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳，相差1bp的DNA片段也能分开，但其操作复杂。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制胶装置聚丙烯酰胺凝胶制胶装置第三

23、节第三节 DNA测序测序SangerSanger双脱氧链终止法和双脱氧链终止法和Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法都是用待化学降解法都是用待测序测序DNADNA制备四组标识制备四组标识DNADNA片段，片段，每组片段每组片段具有以下特征具有以下特征:55端序列相同，端序列相同，33端序列不同端序列不同33端所对应的碱基相同，因而分析该组片段的长度可以确端所对应的碱基相同，因而分析该组片段的长度可以确定这种碱基在待测序定这种碱基在待测序DNADNA链中的位置链中的位置一种碱基在待测序一种碱基在待测序DNADNA链中有多少个，相应片段组所含的链中有多少个，相应片段组所含

24、的DNADNA片段就有多少种，所以在待测序片段就有多少种，所以在待测序DNADNA链中的这种碱基全都链中的这种碱基全都可以定位可以定位分析四组分析四组DNADNA片段的长度片段的长度一、一、Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 二、二、Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法化学降解法三、三、DNA测序自动化测序自动化 思考题思考题 1 1、提取质粒、提取质粒DNADNA包括哪三个基本步骤？包括哪三个基本步骤？2 2、如何用紫外吸收法分析核酸浓度和纯度、如何用紫外吸收法分析核酸浓度和纯度 3 3、核酸电泳的种类（根据电泳支持介质分）及各、核酸电泳的种类（根据电泳支持介

25、质分）及各自特点自特点 4 4、DNADNA测序的两种基本方法及共同步骤，测序的两种基本方法及共同步骤，SangerSanger双脱氧链终止法的关键试剂双脱氧链终止法的关键试剂印迹杂交技术印迹杂交技术分子生物学常用的分析技术之一分子生物学常用的分析技术之一DNADNA印迹法、印迹法、RNARNA印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）第一节第一节 核酸分子杂交核酸分子杂交 核酸杂交技术是在核酸杂交技术是在DNADNA变性和复变性和复性原理的基础性原理的基础上建立起来的一种上建立起来的一种分子生物学技术分子生物学技术 一、变性（一、变性（denaturation）在某

26、些理化因素的作用下，维在某些理化因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，堆积力受到破坏，DNADNA双螺旋结双螺旋结构松散，变成单链的过程称为构松散，变成单链的过程称为核酸的变性核酸的变性 核酸双螺旋区的核酸双螺旋区的氢键断裂氢键断裂，变，变成单链，但并不涉及共价键的成单链，但并不涉及共价键的断裂断裂DNA解链曲线解链曲线DNADNA变性的本质是氢键的断裂变性的本质是氢键的断裂核酸的变性因素核酸的变性因素 变性方法变性方法热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、尿素和甲酰胺）增色效应（增色效应（hyperchromic effecthyperchromi

27、c effect）由于DNA变性而引起的光吸收增加的现象 使双链使双链DNADNA解链度达到解链度达到50%50%所需的温度称为所需的温度称为解链温度解链温度 (Tm)(Tm)、变性温度、变性温度、熔点熔点 DNADNA的解链温度一般在的解链温度一般在82-95 82-95，与，与DNADNA的分子大小和碱基组成、溶液的分子大小和碱基组成、溶液的的pHpH值和离子强度（值和离子强度（+）等有关）等有关 二、复性二、复性 DNADNA复性：缓慢降温可以使热变性复性：缓慢降温可以使热变性DNADNA重新形成重新形成互补双链结构互补双链结构 DNADNA的最适复性温度通常的最适复性温度通常比解链温度

28、低比解链温度低20-2520-25 复性导致复性导致DNADNA的紫外吸收降低，称为减色效应的紫外吸收降低，称为减色效应 检测检测DNADNA紫外吸收的变化可以分析其变性和复性紫外吸收的变化可以分析其变性和复性 不是简单的逆变性过程，受多种因素影响不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:DNADNA浓度越高浓度越高，两股互补链相遇的可能性就越大，因而复，两股互补链相遇的可能性就越大，因而复性越快性越快序列简单的序列简单的DNA(DNA(例如重复序列例如重复序列)复性快复性快，序列复杂的，序列复杂的DNA(DNA(例如单一序列例如单一序列)复性慢，因而可以通过测定复性速度分复性慢，因而可以通过测定

29、复性速度分析析DNADNA序列的复杂性序列的复杂性DNADNA片段越大片段越大，寻找完全互补序列的难度就越大，因而复，寻找完全互补序列的难度就越大，因而复性越慢性越慢DNADNA溶液的溶液的离子强度越高离子强度越高，两股互补链重新结合的速度就，两股互补链重新结合的速度就越快，因而复性越快越快，因而复性越快 DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子三、杂交与核酸分子杂交技术三、杂交与核酸分子杂交技术 杂交定义杂交定义不同来源的、序列互补的单链RNA、DNA，或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连接为双链分子的过程。核酸杂交类型核酸杂交类型单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）单链DN

30、A与单链RNA杂交（DNA-RNA）单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 定义：将定义：将已知序列的单链核酸片段进行标记已知序列的单链核酸片段进行标记后，再后，再与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的表达情况表达情况 探针探针(Probe)(Probe)：是带有标记物且序列已知、用于鉴定是带有标记物且序列已知、用于鉴定互补序列的单链

31、核酸片段互补序列的单链核酸片段根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：1 1、液相杂交：、液相杂交：待测核酸和标记的探针都待测核酸和标记的探针都游离于溶液游离于溶液中，在一定条件中，在一定条件下进行杂交下进行杂交优点：速度快、效率高，操作简便优点：速度快、效率高，操作简便缺点：难以有效避免待测核酸的复性缺点：难以有效避免待测核酸的复性 杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大2 2、固相杂交：、固相杂交：将将待测核酸先固定在固相支持物上待测核酸先固定在固相支持物上，然后与，然后与溶液中的溶液

32、中的游离探针游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的第二节第二节 探针与标记探针与标记 合适的探针具备以下条件合适的探针具备以下条件:具有高度特异性具有高度特异性，只与待测核酸杂交。因此，通，只与待测核酸杂交。因此，通常首选常首

33、选编码序列编码序列制备探针制备探针为单链核酸为单链核酸，用双链核酸制备的探针使用前要先，用双链核酸制备的探针使用前要先变性解链变性解链带有标记物带有标记物，标记物灵敏度高而稳定，检测方便，标记物灵敏度高而稳定，检测方便 一、探针种类一、探针种类 11基因组基因组DNADNA探针（最常用的探针（最常用的DNADNA探针）探针）多为某一基因的全部序列或部分序列多为某一基因的全部序列或部分序列2RNA2RNA探针探针杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强非特异性杂交较少、低本底非特异性杂交较少、低本底 3cDNA3cDNA探针探针 不含内含子等非编码序列，特异性

34、高，研究基因表达不含内含子等非编码序列，特异性高，研究基因表达不易制备不易制备44寡核苷酸探针寡核苷酸探针 根据已知核酸序列人工合成的根据已知核酸序列人工合成的DNADNA探针探针;分析点突变分析点突变55锁式探针锁式探针 一种特别设计的一种特别设计的DNADNA探针，中间为连接序列探针，中间为连接序列66实时定量实时定量PCRPCR探针探针 二、探针标记物二、探针标记物(一一)放射性同位素标记物放射性同位素标记物(3232P P、2 2H H和和3232S)S)极高的灵敏度和特异性极高的灵敏度和特异性放射性污染放射性污染,半衰期短半衰期短,昂贵昂贵(二二)非放射性标记物非放射性标记物(生物素

35、、地高辛和荧光素等生物素、地高辛和荧光素等)实验周期短实验周期短;稳定性好稳定性好,标记探针可以长时间存放备用标记探针可以长时间存放备用;无放无放射性污染射性污染灵敏度和特异性有时不理想灵敏度和特异性有时不理想三、探针标记法三、探针标记法1 1、体内标记：、体内标记：将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子2 2、体外标记（最常用）、体外标记（最常用）：化学法和酶促法：化学法和酶促法化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团进行交联，将

36、的基团进行交联，将标记物直接结合到探针分子标记物直接结合到探针分子上。上。简便快速、标记均匀简便快速、标记均匀酶促法：酶促法：先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转移到探针分子移到探针分子 (一一)切口平移标记法切口平移标记法(二二)随机引物标记法随机引物标记法 末端标记末端标记法法(三三)聚合酶链反应标记法聚合酶链反应标记法 一种标记一种标记dNTPdNTP和三种普通和三种普通dNTPdNTP为底物，短链探针为底物，短链探针(四四)末端标记法末端标记法 T4T4多

37、核苷酸激酶、末端转移酶、多核苷酸激酶、末端转移酶、KlenowKlenow片段和片段和T4 T4 DNADNA聚合酶聚合酶 四、探针纯化四、探针纯化11乙醇沉淀法乙醇沉淀法 DNADNA片段可以被无水乙醇沉淀片段可以被无水乙醇沉淀 操作简便，首选方法操作简便，首选方法22凝胶过滤法凝胶过滤法 利用凝胶的分子筛特性利用凝胶的分子筛特性 凝胶填料是凝胶填料是Sephadex G-50Sephadex G-50和和Bio-Gel P-60Bio-Gel P-60第三节第三节 固相支持物与印迹固相支持物与印迹 一、固相支持物：一、固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙烯二硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙

38、烯二氟氟(PVDF)(PVDF)膜和活化滤纸膜和活化滤纸11硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 结合量大、本底较低、操作简便结合量大、本底较低、操作简便结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆22尼龙膜尼龙膜 韧性较强，不易破裂韧性较强，不易破裂中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜二、印迹方法二、印迹方法 第四节第四节 常用核酸印迹杂交技术常用核酸印迹杂交技术 常用的核酸分子杂交技术常用的核酸分子杂交技术多为固相杂交多为固相杂交 根据操作方法的不同分为根据操作方法的不同分为 印迹杂交：印迹杂交：将凝胶电泳的高分辨率与核酸分子杂交的将凝胶电泳的高分辨率与核酸

39、分子杂交的高灵敏度相结合，包括高灵敏度相结合，包括DNADNA印迹法和印迹法和RNARNA印迹法等印迹法等 原位杂交：原位杂交：包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌斑杂交法等斑杂交法等 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂洗去除未参与杂交的标记探针一、一、DNA印迹法印迹法 1.1.样品制备

40、；样品制备；2.2.电泳分离；电泳分离；3.3.变性；变性；44印迹；印迹；55固定；固定；66预杂交；预杂交；7.7.杂交；杂交；88洗膜；洗膜；99分析分析 放射自显影照片放射自显影照片二、二、RNA印迹法印迹法 RNARNA印迹法分析的印迹法分析的待测核酸是待测核酸是RNARNA与与DNADNA印迹法基本一致印迹法基本一致，所不同的是，所不同的是:为了保持为了保持RNARNA呈单链状态进行电泳，以使呈单链状态进行电泳，以使RNARNA按分子大小分离，需要按分子大小分离，需要先用变性剂将先用变性剂将RNARNA样品完全变性样品完全变性，再电泳分离，再电泳分离 RNARNA样品只能用样品只能

41、用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜甲醛、乙二醛、二甲基亚砜 (DMSO)(DMSO)等变性等变性，不能不能用碱变性用碱变性，因为碱会导致，因为碱会导致RNARNA降解。降解。RNARNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNARNA或某一特定或某一特定RNARNA，特别是分析，特别是分析mRNAmRNA的大小和含量，从而研究的大小和含量，从而研究基因表达基因表达。避免避免RNaseRNase污染污染，包括抑制内源性，包括抑制内源性RNaseRNase的活性的活性三、斑点杂交法和狭缝杂交法三、斑点杂交法和狭缝杂交法将将粗制或纯化的粗制或纯化的DNADNA

42、或或RNARNA样品变性之后直接点于固样品变性之后直接点于固相膜表面相膜表面，经过固定、预杂交之后与过量探针进行，经过固定、预杂交之后与过量探针进行杂交分析杂交分析印迹印迹:圆斑圆斑(dot),(dot),短线短线(slot)(slot)用于检测用于检测DNADNA样品的样品的同源性、细胞内特定基因的拷同源性、细胞内特定基因的拷贝数和基因表达贝数和基因表达情况情况优点优点:用样量少，操作简便用样量少，操作简便，不电泳和转移，在同，不电泳和转移，在同一张固相膜上可以分析多个样品一张固相膜上可以分析多个样品缺点缺点:特异性不高特异性不高,不能分析样品的不能分析样品的分子量分子量 斑点杂交和狭缝杂交

43、斑点杂交和狭缝杂交 制备样品点样固定（可用斑点杂交仪或直接点样）优点：优点：简便、快速、灵敏、样本用量少 缺点：缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性NCF滤 纸点 样 板支 撑 板至 真 空 泵废 液 储 槽96孔12 8四、组织原位杂交四、组织原位杂交(in situ hybridization)把把组织切片组织切片进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与DNADNA或或RNARNA杂交杂交以以cDNAcDNA为探针检测与其互补的为探针检测与其互补的mRNAmRNA在细菌或

44、其他真核细在细菌或其他真核细胞中的位置，称为胞中的位置，称为RNARNA原位杂交原位杂交，是分析基因表达的常用，是分析基因表达的常用方法方法不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸的组织、细胞、亚细胞甚至染色体的组织、细胞、亚细胞甚至染色体定位定位分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式荧光原位杂交荧光原位杂交 (FISH)(FISH)是用荧光素标记探针进行的原位杂是用荧光素标记探针进行的原位杂交交灵敏、稳定、安全、直观灵敏、稳定、安全、直观多色荧光原位杂交可以多色荧光原位杂交可以同时分析多

45、种靶序列同时分析多种靶序列 荧光标记探针检测精子荧光标记探针检测精子五、菌落杂交和噬菌斑杂交五、菌落杂交和噬菌斑杂交 六、等位基因特异性寡核苷酸杂交六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH)ASOHASOH：最早检测已知：最早检测已知点突变点突变，目前广泛采用的，目前广泛采用的基因诊断方法基因诊断方法关键：设计一对关键：设计一对ASOASO，长度，长度15-20nt15-20nt，只有一个碱基不同，对应突变位点（，只有一个碱基不同，对应突变位点（正正常探针，突变探针常探针，突变探针）诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症(PKU)(PKU)，根据某个突变位点，根据某个

46、突变位点 (例如例如Arg243Gln)Arg243Gln)设计一对探针设计一对探针:用两种探针分别和待测用两种探针分别和待测DNADNA杂交，杂交，显性纯合子只与正常探针杂交显性纯合子只与正常探针杂交，杂杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因此，因此根据杂交结果可以判断待测个体的基因型根据杂交结果可以判断待测个体的基因型苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子第五节第五节 影响杂交的因素影响杂交的因素 核酸分子杂交的效果取决于杂交的核酸分子杂交的效果取决于杂交的特异性特异性和杂交的和杂交的

47、效率效率11核酸分子大（核酸分子大（）小和浓度（正相关）小和浓度（正相关）发生碰撞才可能发生碰撞才可能杂交杂交22探针种类和浓度探针种类和浓度：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而提高，双链探针与此相反提高，双链探针与此相反33杂交温度杂交温度：最适杂交温度：最适杂交温度(比解链温度低比解链温度低20-2520-25时时)；特异；特异性性44离子强度和离子强度和甲酰胺浓度甲酰胺浓度：最适杂交温度最适杂交温度5.5.杂交时间杂交时间：控制在：控制在2020小时左右小时左右66杂交促进剂杂交促进剂:250nt250nt探针杂交用惰性多聚体探针杂交用惰性多聚体(硫酸

48、葡聚糖硫酸葡聚糖/PEG)/PEG)7.7.非特异性杂交非特异性杂交：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性DNA DNA、高分子化合物）封闭非特异性杂交位点高分子化合物）封闭非特异性杂交位点第六节第六节 蛋白质印迹法蛋白质印迹法 蛋白质印迹法可以用于蛋白质印迹法可以用于定性和半定定性和半定量分析量分析混合物中的蛋白质混合物中的蛋白质 综合了综合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高高和固相和固相免疫分析特异性高、灵敏免疫分析特异性高、灵敏度高度高等优点等优点一、基本内容一、基本内容 二、注意事项二、注意事项11选用合适的选用合适的聚丙烯酰胺凝胶浓

49、度聚丙烯酰胺凝胶浓度22印迹时，应选用印迹时，应选用小孔径的固相膜小孔径的固相膜，以免小分子量，以免小分子量蛋白质透过固相膜丢失蛋白质透过固相膜丢失33蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，所以一般只用于所以一般只用于半定量分析半定量分析即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是否存在，比较其在不同细胞内的含量否存在，比较其在不同细胞内的含量不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有可比性可比性 三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较第七节第七节 生物芯片生物芯片

50、 定义：定义：也称为也称为生物微阵列生物微阵列，是指通过，是指通过微电子、微加工技术微电子、微加工技术，用，用生物大生物大分子分子 (例如核酸、蛋白质例如核酸、蛋白质)或或细胞细胞等在数平方厘米大小的等在数平方厘米大小的固相介质表固相介质表面面构建的构建的微型分析系统微型分析系统，用以对生物组分进行，用以对生物组分进行快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏的分的分析与处理析与处理种类：种类：基因基因芯片、芯片、蛋白质蛋白质芯片、芯片、组织组织芯片、芯片、微流控微流控芯片和芯片芯片和芯片实验室实验室 固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龙膜等固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼