EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测课件.ppt
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1、EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测一一二二三三四四五五背景介绍背景介绍实验流程实验流程实验步骤实验步骤预期结果预期结果 参考文献参考文献contents第几章一、背景介绍l 1、绿色荧光蛋白(GFP) l 2、质粒l 3、大肠杆菌表达载体及表达系统l 4、SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测1 -绿色绿色荧光蛋白荧光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现GFP发光的遗传标签科研1 -绿色绿色荧光蛋白(荧光蛋白(GFP)1.1发现GFP 的分子质量为26 kDa,晶体结构如左图所示。蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构, 长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠
2、组成,荧光基团的形成就是从该螺旋开始,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6567位的“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸” 自身环化和氧化形成。1 -绿色绿色荧光蛋白(荧光蛋白(GFP)1.2特性GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395 nm,另一小吸收峰为470 nm,最大发射峰为505 nm。1 -绿色绿色荧光蛋白荧光蛋白1.2特性1 -绿色绿色荧光蛋白荧光蛋白1.2特性优点:易于检测,荧光稳定,无毒害,通用性,易于构建载体,活细胞观察1 -绿色绿色荧光蛋白荧光蛋白1.3应用生物学研究生态学研究医学研
3、究2 -质粒质粒2.1pEGFP-N3质粒2 -质粒质粒2.1.1 pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N3 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP (13) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 nm; emission maximum = 507 nm.) pEGFP-N3 encodes the GFPmut1 variant (4) w
4、hich contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation ini
5、tiation site (6) to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-N3 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the EGFP coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N terminus of EGFP if they are in the same re
6、ading frame as EGFP and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3 end of the EGFP mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen. A neomycin
7、 resistance cassette (Neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upst
8、ream of this cassette expresses kanamycin resistance in E. coli. The pEGFP-N3 backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.2 -质粒质粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用Fusions to the N terminus of EGFP retain the fluorescent properties
9、of the native protein allowing the localization of the fusion protein in vivo . The target gene should be cloned into pEGFP-N3 so that it is in frame with the EGFP coding sequences, with no intervening in-frame stop codons. The inserted gene should include the initiating ATG codon. The recombinant E
10、GFP vector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (7). pEGFP-N3 can also be used simply to express EGFP in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker).2 -质粒质粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp1394b
11、ppEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒,它编码GFPmut1突变体,发生了两个氨基酸的替换。2 - 质粒质粒2.1.4 pEGFP-N3的EGFPLeu Phe-64 Ser-65 Thr 荧光强度增加了35倍2 -质粒质粒2.1.5 编码EGFP的基因片段 6751394bp 长度720 bp651 GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT700701 CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750751 ACAAGTTCAGCGTGT
12、CCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800801 CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850851 CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900901 CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950951 TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC10001001 CCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGAC
13、ACCCTGGTGAACCGCATCGAGC10501051 TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG11001101 GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA11501151 GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA12001201 GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC12501251 CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGC
14、ACCCAGTCCGCCCTGAG13001301 CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA13501351 CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGC14001401 CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT14502 -质粒质粒2.2pET28a质粒2 -质粒质粒2.2.1 pET28a质粒描述The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal HisTag/ thrombin
15、/ T7Tag configuration plus an optional C-terminal HisTag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7
16、RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).2 -质粒质粒2.
17、2.2 pET28a质粒图谱卡那霉素抗性卡那霉素抗性2 -质粒质粒2.2.2pET28a质粒图谱3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌表达系统如下: T7表达系统:T7噬菌体RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录,其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的35倍 Lac表达系统是-半乳糖甘酶编码基因lac Z的转录的调控序列,该启动子可以被IPTG诱导,所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。 Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子,其强度得到了很大的提高,也可被IPTG诱导 PL表达系统是负责
18、 DNA分子转录的启动子之一,是一种很强的启动子一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成。3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点: 易于生长和控制; 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵; 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.3
19、原核表达载体选择标志的编码序列可控转录的启动子转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点)一个多限制酶切位点接头宿主体内自主复制的序列3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统宿主菌宿主菌载体载体筛选筛选启动子启动子融合标签融合标签BL21(DE3)pET28a卡那霉素T7 lacHis-Tag T7-Tag3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。而BL21(
20、DE3)就是一株由LacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌pET28a是具有His标签,利用T7 RNA聚合酶系统在大肠杆菌中诱导型高效表达外源蛋白的表达质粒,外源基因可与N端的His标签或者T7标签融合,以提高外源基因的表达量。3 - 大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌表达载体及表达系统3.5宿主菌的表达4 - SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理4 - SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理第几章二、实验流程第几点第几点实验流程实验流程大肠杆菌E.coli DH5阳性克隆转化BL21(DE3)IPTG诱导表达SDS-PAGE分离检测第几章三、实验步骤第几章扩增菌株提
21、取质粒 EGFP基因的PCR扩增和回收EGFP基因和pET28a载体的双酶切pET28a-EGFP重组表达载体的构建EGFP基因的原核表达与检测SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质(含pEGFP-N3和pET-28a的大肠杆菌DH5)(1)固-液接种:从LB平板上挑取含有以上质粒的E.coli DH5单菌落,接种于5mL LB培养基中,37 振荡培养过夜。(2)液-液转接:以1%接种量将过夜培养的E.coli DH5接种于新鲜LB培养基中,37,220 rpm振荡培养22.5h。1-扩增菌株及提取质粒扩增菌株及提取质粒1.1扩增菌株(1)取1.05.0 mL的菌液,室温下13000 rpm离心1
22、 min收集细菌。(2)倒弃培养基,加入250 L Solution/RNase A混合液,涡旋振荡使细胞完全悬浮。(3)往重悬混合液中加入250 L Solution ,轻轻颠倒混匀46次,此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5 min。(4)加入250 L Solution ,温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。(5)室温下,13000 rpm离心10 min。(6)转移上清液至套有2 mL收集管的HiBind DNA结合柱中,室温下,13000 rpm离心1 min,倒去收集管中的滤液。(7)把柱子重新装回收集管,加入500 L HB Buffer,按上述条件离心,弃去滤液。(8)把柱子
23、重新装回收集管,加入700 L DNA Wash Buffer,按上述条件离心,弃去滤液(注意:浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释)。(9)弃去滤液,把柱子重新装回收集管,13000 rpm离心空柱2 min以甩干柱子基质(注意:不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关重要)。(10)把柱子装在干净的1.5 mL离心管上,加入50 L Elution Buffer到柱子基质中,静置1 2min,13000 rpm离心1 min,洗脱出DNA。1-扩增菌株及提取质粒扩增菌株及提取质粒1.2提取质粒(pEGFP-N3、pET28a)2-EGFP基因的PCR
24、扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增EcoR (192)Hind (173)2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增以pEGFP-N3中的EGFP片段作为PCR反应的模板,设计引入Eco R I酶切位点的上游引物(5-GGA GAATTCATGGTGA
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