基因工程应用概述课件.ppt

1、8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 1基因工程基因工程Gene Engineering授课课时课时:40 40 学时，学时，实验：实验：20 20 学时学时 (S502),(S502),第第3 3周开始周开始(1(1单单2 2双周双周)考试方式考试方式:笔试笔试上课地点上课地点:1208，3511（69周）周）任课教师任课教师:谭志远教授，谭志远教授，办公室办公室，S508联系电话联系电话:85288311,Email 8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听

2、课！Slide 2课程要求课程要求 通过本课程的学习，通过本课程的学习，掌握基因工程的掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。一些基本原理和基本操作技术等。总成绩平时（总成绩平时（2020）实验（）实验（3030）考试（考试（5050）平时成绩平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面讨论、遵守课堂纪律等方面)8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 3教材和参考文献教材和参考文献1.楼士林等，基因工程，科学出版社，楼士林等，基因工程，科学出版社，20022.吴乃虎，基因工程

3、原理（第二版上、下册），科学出版吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，社，19983.张惠展编著，张惠展编著，1999年出版，年出版，基因工程概论基因工程概论，华东理，华东理工大学出版社。工大学出版社。4.Watson,J.D et al.Recombinant DNA,W.H.Freeman and Company,New York,2ed,19925.Robert F.Weaver,Molecular Biology,科学出版社科学出版社,2000（影印版）（影印版）8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slid

4、e 4本课程内容本课程内容 第一章第一章 绪论绪论 第二章第二章 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶 第三章第三章 基因工程的载体基因工程的载体 第四章第四章 目的基因的制备目的基因的制备 第五章第五章 目的基因导入和重组子的筛选目的基因导入和重组子的筛选 第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达 第七章第七章 基因操作的基本技术基因操作的基本技术 第八章第八章 植物基因工程及应用植物基因工程及应用 第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用 第十章第十章 医学基因工程及应用医学基因工程及应用8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学

5、们听课！Slide 5第九章第九章 动物基因工程及应用动物基因工程及应用第一节第一节 动物基因工程的基本概念动物基因工程的基本概念第二节第二节 动物基因基因转移的方法动物基因基因转移的方法第三节第三节 动物基因工程应用动物基因工程应用8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 6引言 20世纪70年代末至80年代初，借助于受精卵显微注射和早期胚胎细胞的逆转录病毒感染等手段，将功能基因引入高等动物的染色体DNA上，实现了种系内和种系间细胞的基因转移。多利绵羊克隆的成功，意味着不仅可以将任何基因转入包括人体在内的任何细胞中，而且

6、还能使转基因动物像重组微生物那样繁殖。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 78/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 8第一节第一节 动物基因工程的基本概念动物基因工程的基本概念 一、转基因与转基因生物一、转基因与转基因生物转基因生物转基因生物（Genetical modified Orgamism，GMO；Transgenic Organism，TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育为个体。转基因通常是指在基因操作过程中整合到动植物受体

7、细胞基因组中的外源基因。从八十年代初以来，动物的转基因技术已得到了长足的进展，转基因鼠、绵羊。猪、兔、牛、鸡等都已相继获得成功，人类的转基因技术目前局限在体细胞的基因治疗方面，具有遗传特征修饰的转基因人研究仍受到伦理学和法学的束缚，末能跨出第一步，但这并不意味着在技术上有不可逾越的障碍。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 9二、动物转基因技术的基因原理（一）转基因的效率（一）转基因的效率通常，动物基因转移的起点是受精卵，终点是含有整合型外源基因的动物子代。转基因的总有效率为：阳性动物子代数/转基因受精卵数以转基因小鼠

8、为例：注射外源基因后受精卵的存活率为86%将受精卵植入受体鼠体内后受精卵的存活率为25%移植田鼠的怀孕率为80%转基因的整合率为24%因此，转基因的总有效率为：4%另外，外源基因的大小也是转基因效率的一个指标，不同的基因转移方法所转入的允许范围也不同，8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 10一般的，显微注射可达几一般的，显微注射可达几kb-250kb；酵母人工染色体；酵母人工染色体（YAC)转基因至胚胎干细胞可达转基因至胚胎干细胞可达670kb；病毒为载体；病毒为载体可转移的片段一般不超过可转移的片段一般不超过20k

9、b。（二）转基因的共抑制效应（二）转基因的共抑制效应（Co-suppression）在转基因动物的研究中，转基因的表达特性常会在转基因动物的研究中，转基因的表达特性常会出现许多出人意料又难以解释的现象。其中最普遍的出现许多出人意料又难以解释的现象。其中最普遍的现象便是转基因的失活，也称为转基因的沉默，这种现象便是转基因的失活，也称为转基因的沉默，这种现象在转基因动植物中均有发生。迄今为止，转基因现象在转基因动植物中均有发生。迄今为止，转基因的失活现象在转基因植物中研究得较深入。研究表明，的失活现象在转基因植物中研究得较深入。研究表明，转基因的失活机制是转基因与内源基因（同源基因）转基因的失活机

10、制是转基因与内源基因（同源基因）的共抑制效应，即当受体细胞基因组中含有转基因的的共抑制效应，即当受体细胞基因组中含有转基因的同源基因时，转基因与内源基因的表达同时受到抑制同源基因时，转基因与内源基因的表达同时受到抑制.8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 11I 共抑制效应的特征共抑制效应的特征i 共抑制只发生在转基因与同源基因之间，而不共抑制只发生在转基因与同源基因之间，而不影响其它基因的表达。影响其它基因的表达。ii 转基因与内源基因发生体内重组后，共抑制转基因与内源基因发生体内重组后，共抑制效应消失，基因表达恢复

11、正常。效应消失，基因表达恢复正常。iii 共抑制现象的发生与结构编码区有关，而与共抑制现象的发生与结构编码区有关，而与启动子的来源无关。启动子的来源无关。iv 两个相同的转基因之间也发生共抑制效应，两个相同的转基因之间也发生共抑制效应，这也许是转基因动植物中单拷贝的转基因通常具有最这也许是转基因动植物中单拷贝的转基因通常具有最高表达率的原因。高表达率的原因。II 共抑制效应的产生机制假说共抑制效应的产生机制假说i 转基因与同源基因相互作用，形成某种后成状转基因与同源基因相互作用，形成某种后成状态而影响两者的表达态而影响两者的表达8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学

12、们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 12ii 转基因与内源基因因竞争性结合核基质，核包转基因与内源基因因竞争性结合核基质，核包膜上转录翻译必须的不扩散元件而出现相互抑制。膜上转录翻译必须的不扩散元件而出现相互抑制。iii 两者形成互为反义两者形成互为反义RNA，使之失活并快速降，使之失活并快速降解。解。iv 由于外源基因的存在，由于外源基因的存在，mRNA大量积累，并大量积累，并激活某些未知酶素，导致激活某些未知酶素，导致mRNA降解。降解。III 转基因失活的可能原因：有时，转基因单方面转基因失活的可能原因：有时，转基因单方面失活，其同源的内源基因仍表达。失活，其同源的内源基因仍

13、表达。i 转基因被受体细胞识别为异己转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将之甲，并将之甲基化修饰，使其失活。基化修饰，使其失活。ii 转基因整合在不合适的染色体部位，受局部转基因整合在不合适的染色体部位，受局部区域的影响而不表达。区域的影响而不表达。iii 转基因本身的结构对其表达的影响因素，如转基因本身的结构对其表达的影响因素，如调控元件，内含子结构的存在与否等等。调控元件，内含子结构的存在与否等等。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 13第二节第二节 动物基因基因转移的方法动物基因基因转移的方法 一、动物基因工程

14、的载体一、动物基因工程的载体动物基因工程的载体主要有以下几种：动物基因工程的载体主要有以下几种：.猿病毒（猿病毒（SV40）双链环状双链环状DNA，5226bp8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 14SV40的结构8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 158/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 16 2.腺病毒（腺病毒（Adenovirus）线状双链线状双链DNA，36

15、kb,包装上限包装上限37.8kb,修饰后上限修饰后上限4kb。3.牛痘病毒牛痘病毒185kb，操作困难，操作困难,先以重组病毒感染细胞，使其大量先以重组病毒感染细胞，使其大量表达表达T7 RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启启动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入细胞。经过动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入细胞。经过一段时间预培养，外源基因即在一段时间预培养，外源基因即在T7 RNA聚合酶作用下聚合酶作用下转录并翻译出异源蛋白。转录并翻译出异源蛋白。4.逆转录病毒逆转录病毒整合型单链整合型单链RNA病毒，装配大小病毒，装配大小8kb。感染后，由逆。感染后，

16、由逆转录酶作用下，形成双链转录酶作用下，形成双链DNA，插入寄主基因组复制，插入寄主基因组复制，转录成转录成mRNA，装配分泌到胞外，不造成宿主细胞死，装配分泌到胞外，不造成宿主细胞死亡。亡。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 175.pBR322和和BVP分子的穿梭载体分子的穿梭载体在动物基因工程中，经常使用启动子有以下几种：在动物基因工程中，经常使用启动子有以下几种：热休克基因家族启动子热休克基因家族启动子pHS（热休克因子诱导）（热休克因子诱导）病毒长末端重复序列启动子（糖皮质激素）病毒长末端重复序列启动子（糖

17、皮质激素）金属硫蛋白基因启动子（重金属诱导）金属硫蛋白基因启动子（重金属诱导）二、基因转移的方法二、基因转移的方法动物基因转化的方法主要有：动物基因转化的方法主要有：物理转化法，病毒物理转化法，病毒介导法和工程胚胎干细胞法介导法和工程胚胎干细胞法。常用的方法主要有以下。常用的方法主要有以下几种。几种。（一）逆转录病毒感染法（一）逆转录病毒感染法I 基本程序：基本程序：1)构建逆转录病毒构建逆转录病毒DNA与质粒与质粒DNA的异源的异源DNA型克隆载体。型克隆载体。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 18 2)克隆基因

18、重组异源克隆基因重组异源DNA型载体，在大肠杆菌型载体，在大肠杆菌等原核受体细胞中筛选、鉴定重组体。等原核受体细胞中筛选、鉴定重组体。3)通过物理方法将重组通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞分子转入包装细胞系（通常是小鼠细胞系）系（通常是小鼠细胞系）采用的方法包含：磷酸钙沉淀法，采用的方法包含：磷酸钙沉淀法，DNA+磷酸缓磷酸缓冲冲+CaCL2电穿孔法，脂质体包埋法电穿孔法，脂质体包埋法4)重组重组DNA分子转录出分子转录出RNA重组分子，包装细重组分子，包装细胞合成包装蛋白包装成熟颗粒。胞合成包装蛋白包装成熟颗粒。5)收集逆转录重组病毒，感染收集逆转录重组病毒，感染8细胞阶段的小鼠细胞

19、阶段的小鼠胚胎细胞。胚胎细胞。6)利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞。利用标记基因筛选整合型转基因胚胎细胞。7)移植入小鼠母体体内。移植入小鼠母体体内。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 19 II 优缺点：优缺点：1)优点：优点：能有效地将转基因整合入受体能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区区域内进行，不会破坏转基因结构域内进行，不会破坏转基因结构2)缺点：缺点：载量

20、较小一般只有载量较小一般只有8kb可能会因可能会因缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管种系载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细种系载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农

21、业生物技术班同学们听课！Slide 20（二）（二）DNA显微注射法显微注射法I 基本程序：基本程序：1)通过激素疗法使田鼠超数排卵，通过激素疗法使田鼠超数排卵，48小时后再注小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时田鼠便会超数排卵，一射人绒毛膜促进腺激素，这时田鼠便会超数排卵，一般情况下般情况下5-10个，超数排卵为个，超数排卵为35个。个。2)与雌性小鼠交配，然后杀掉田鼠，从其输卵管与雌性小鼠交配，然后杀掉田鼠，从其输卵管内取出受精卵。内取出受精卵。3)将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内。大的雄性原核内。4)将将25-40个注射转基因

22、的受精卵移植入田鼠体内。个注射转基因的受精卵移植入田鼠体内。5)受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 21 6)从小鼠子代体内提取从小鼠子代体内提取DNA样品，杂交鉴定转基因的样品，杂交鉴定转基因的整合与否及位点。整合与否及位点。7)子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达传及表达II 优缺点优缺点：1)优点：优点：转基因范围广，且可转移较大转基因范围广，且可转移较大DNA片片段，可达

23、数百段，可达数百kb；转基因不含任何病毒基因组片段，；转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。绝对安全。2)缺点：缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等。转动物基因组的重排、突变、易位缺失等。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 22三、工程胚胎干细胞法三、工程胚胎干细胞法多效性胚胎干细胞（多效性胚胎干细胞（ES）：胚胎发育到卵泡阶段的）：胚胎发育到卵泡阶段的细

24、胞能在培养基中体外扩增，重新输入到胚胎胚泡后，细胞能在培养基中体外扩增，重新输入到胚胎胚泡后，仍保留分化成其他细胞的能力。仍保留分化成其他细胞的能力。在体外培养时，在体外培养时，ES细胞能方便地承受转基因操作细胞能方便地承受转基因操作而不影响其分化多效性，利用这个系统，一个功能转而不影响其分化多效性，利用这个系统，一个功能转基因可被整合在基因可被整合在ES细胞基因组中的一个非必须基因的细胞基因组中的一个非必须基因的特异位点上，构成工程化胚胎干细胞，经过筛选鉴定，特异位点上，构成工程化胚胎干细胞，经过筛选鉴定，体外增殖，最后输回小鼠胚胎胚泡中，形成转基因动体外增殖，最后输回小鼠胚胎胚泡中，形成转

25、基因动物，在这种方法中，整合的随机性可以避免。物，在这种方法中，整合的随机性可以避免。绝大多数的绝大多数的ES细胞不能整合细胞不能整合DNA，采用正负选择，采用正负选择方法可将整合在特异位点上的转基因方法可将整合在特异位点上的转基因ES细胞选出，并细胞选出，并在体外富集这种细胞。在体外富集这种细胞。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 23I 转基因选择载体的构建转基因选择载体的构建转基因选择载体通常包括下列部分：转基因选择载体通常包括下列部分：1)两个同源两个同源DNA片段（片段（HB1,HB2），它们与），它们与E

26、S细胞中某一必需基因两端同源，保证转基因及标记基细胞中某一必需基因两端同源，保证转基因及标记基因因neor通过同源交换定向整合在通过同源交换定向整合在ES的这一非必需基因的这一非必需基因内部。内部。2)转基因（转基因（TG），必须能赋予受体），必须能赋予受体ES细胞新细胞新的功能。的功能。3)新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor）赋予受体细胞对）赋予受体细胞对G418的抗性的抗性4)胸腺嘧啶激酶基因（胸腺嘧啶激酶基因（tR1、tR2），来自单纯），来自单纯疮疹病毒基因组的疮疹病毒基因组的I型型II型不同基因。型不同基因。tR基因实质上是基因实质上是自杀基因，其产物可将一种化合物（自杀基因，

27、其产物可将一种化合物（Gancyclovir，8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 24 GCV）转化成对细胞毒性的化合物，杀死细胞。）转化成对细胞毒性的化合物，杀死细胞。II 转基因转基因ES细胞的筛选细胞的筛选1)正选择法筛选出转基因整合型正选择法筛选出转基因整合型ES细胞：通过细胞：通过物理方法将重组物理方法将重组DNA分子导入分子导入ES细胞，在含有抗菌素细胞，在含有抗菌素G418的培养基中体外培养的培养基中体外培养ES 细胞。由于重组分子是细胞。由于重组分子是复制缺陷型的，所以在子代复制缺陷型的，所以在子代E

28、S细胞中，重组分子已经细胞中，重组分子已经转化入转化入ES细胞的基因组中。细胞的基因组中。2)负选择法筛选出特异整合型负选择法筛选出特异整合型ES细胞：如果非细胞：如果非特异性整合发生，则两个特异性整合发生，则两个tR基因或其中一个基因很大基因或其中一个基因很大可能与可能与TG和和neor一起整合，这时用一起整合，这时用GCV筛选，其表达筛选，其表达产物将杀死非整合型产物将杀死非整合型ES细胞，而特异性整合是通过双细胞，而特异性整合是通过双交叉同源交换实现的。因此两个交叉同源交换实现的。因此两个tR基因就被排除，显基因就被排除，显示出示出GCV抗性，并生长。抗性，并生长。8/2/2022 12

29、:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 253)PCR法鉴定整合型法鉴定整合型ES细胞：制备细胞：制备ES 细细胞染色体胞染色体DNA，设计，设计PCR引物，进行引物，进行PCR扩增，扩增，鉴定外源基因是否在受体细胞中存在。鉴定外源基因是否在受体细胞中存在。P1：与：与neor基因同源（动物细胞内不存在基因同源（动物细胞内不存在neor基因）基因）P2：与：与ES细胞染色体细胞染色体HB1基因左边外围邻近区基因左边外围邻近区域同源（域同源（CS区）区）不幸的是不幸的是ES的多效性并没有发现在：牛、羊、的多效性并没有发现在：牛、羊、猪、鸡中。猪

30、、鸡中。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 26第三节第三节 动物基因工程应用动物基因工程应用 动物基因工程的应用主要体现在以下动物基因工程的应用主要体现在以下三个方面三个方面：a.研究基因的表达与功能研究基因的表达与功能b.改良物种（牛、鼠、羊、猪、鸡、鱼）改良物种（牛、鼠、羊、猪、鸡、鱼）c.作为生物反应器生产重组蛋白，主要是医药。在作为生物反应器生产重组蛋白，主要是医药。在人类中，基因工程的主要用途是基因治疗。人类中，基因工程的主要用途是基因治疗。一、利用动物转基因技术研究基因的表达与功能一、利用动物转基因技术

31、研究基因的表达与功能转基因进入动物细胞后，如果受体细胞基因组上转基因进入动物细胞后，如果受体细胞基因组上也有存在着同源伙伴，那么转基因的功能研究就会受也有存在着同源伙伴，那么转基因的功能研究就会受到限制。在微生物中，通常是通过突变体研究基因的到限制。在微生物中，通常是通过突变体研究基因的功能。但在动物细胞中，由于大量内含子及非编码顺功能。但在动物细胞中，由于大量内含子及非编码顺序的存在，降低了突变频率。因此大都采用内源基因序的存在，降低了突变频率。因此大都采用内源基因定向灭活的方法。定向灭活的方法。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们

32、听课！Slide 27 转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况：转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况：a.同源重组灭活细胞内源基因同源重组灭活细胞内源基因转基因进入动物细胞内后，通常会发生随机整合，转基因进入动物细胞内后，通常会发生随机整合，这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十分罕见，其同源重组频率只及随机整合的千分之一。分罕见，其同源重组频率

33、只及随机整合的千分之一。然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其子代体内观察转基因的表型。子代体内观察转基因的表型。b.反义反义RNA或反义或反义DNA抑制内源基因表达抑制内源基因表达这种战略是通过抑制这种战略是通过抑制mRNA转录而关闭内源基因，转录而关闭内源基因，8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们

34、听课！Slide 28 而不是灭活内源基因本身，其方法有：而不是灭活内源基因本身，其方法有：1）反义反义RNA体外合成：由体外合成：由mRNA作模板，细菌作模板，细菌RNA聚合酶催化合成聚合酶催化合成mRNA的反义的反义RNA显微注射进入显微注射进入受体细胞，阻止细胞内源基因的表达。受体细胞，阻止细胞内源基因的表达。2）单链单链DNA体外合成：根据靶基因顺序，体外体外合成：根据靶基因顺序，体外设计并合成一小段设计并合成一小段DNA单链（反义单链（反义DNA），它与靶基），它与靶基因因mRNA5端的翻译起始区互补，并抑制其翻译。然端的翻译起始区互补，并抑制其翻译。然后将高浓度的单链反义后将高浓度

35、的单链反义DNA片段直接加入细胞培养基片段直接加入细胞培养基中，由于这种反义中，由于这种反义DNA分子量小，细胞会以较低的频分子量小，细胞会以较低的频率吸收。如果将这些反义率吸收。如果将这些反义DNA进行一些化学修饰，那进行一些化学修饰，那么共转化效率和胞内的稳定性均会大幅度提高。么共转化效率和胞内的稳定性均会大幅度提高。3）反义反义RNA的体内表达载体构建：构建原理是的体内表达载体构建：构建原理是将靶基因反向接在一个强启动子的下游，将靶基因反向接在一个强启动子的下游，8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 29 将这一

36、反义将这一反义RNA分子，并以绝对的浓度优势，与细胞分子，并以绝对的浓度优势，与细胞内靶基因内靶基因mRNA结合，这些双链杂交分子不久便被结合，这些双链杂交分子不久便被RNase水解掉。水解掉。c.利用报告基因探测调控序列利用报告基因探测调控序列 二、改良动物遗传性状二、改良动物遗传性状将抗病毒基因或编码优良性状的基因转入动物受将抗病毒基因或编码优良性状的基因转入动物受精卵后，发育成的动物个体理论上应具有抗病毒或获精卵后，发育成的动物个体理论上应具有抗病毒或获得优良性状的表型。如：将人的促生长激素具有转入得优良性状的表型。如：将人的促生长激素具有转入鱼体内可提高其生长速度鱼体内可提高其生长速度

37、5倍；用胞内免疫法已培养出倍；用胞内免疫法已培养出抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种和抗流感抗鸡白细胞组织增生病毒的转基因鸡新品种和抗流感病毒的转基因小鼠；将抗冻蛋白基因转入鲑鱼中，使病毒的转基因小鼠；将抗冻蛋白基因转入鲑鱼中，使其在冰窟中也能繁殖；澳大利亚培育出的转基因山羊，其在冰窟中也能繁殖；澳大利亚培育出的转基因山羊，羊毛增产羊毛增产5%.8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 30（一）转基因鼠（一）转基因鼠转基因鼠的应用主要是构建人类分子病研究和药转基因鼠的应用主要是构建人类分子病研究和药物筛选试验的模型，

38、绘制高等哺乳动物尤其是人类基物筛选试验的模型，绘制高等哺乳动物尤其是人类基因组功能谱。转基因鼠模型可在短时间内刺激人体疾因组功能谱。转基因鼠模型可在短时间内刺激人体疾病的发生与发展，同时又能为基因治疗提供试验系统。病的发生与发展，同时又能为基因治疗提供试验系统。如老人痴呆症、关节炎、肌肉营养不良症、肿瘤、高如老人痴呆症、关节炎、肌肉营养不良症、肿瘤、高血压、变性神经病、内分泌功能紊乱，心血管冠状动血压、变性神经病、内分泌功能紊乱，心血管冠状动脉疾病等。脉疾病等。现以老年痴呆症为例：现以老年痴呆症为例：老年痴呆症是一种变性脑机能紊乱疾病。其特征老年痴呆症是一种变性脑机能紊乱疾病。其特征是：抽象思

39、维和记忆力的损失，甚至发生语言障碍。是：抽象思维和记忆力的损失，甚至发生语言障碍。虽然在虽然在60-65岁的老人中约有岁的老人中约有1%，80岁以上的老人中岁以上的老人中30%患有此症，但临床诊断及治疗效果较差，原因是患有此症，但临床诊断及治疗效果较差，原因是病理不详。病理不详。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 31 在老年痴呆症病人脑的新皮层和海马中，神经原纤维在老年痴呆症病人脑的新皮层和海马中，神经原纤维粘团在神经元细胞体内大量积累。一种叫做老化斑块粘团在神经元细胞体内大量积累。一种叫做老化斑块的稠密聚集体在轴

40、突末端形成。而脑细胞神经元消失的稠密聚集体在轴突末端形成。而脑细胞神经元消失了。另外，在脑血管中还存在着一些称为淀粉状体的了。另外，在脑血管中还存在着一些称为淀粉状体的蛋白聚集物。老化斑和淀粉状体的主要成分是一个蛋白聚集物。老化斑和淀粉状体的主要成分是一个4KD的蛋白，称为的蛋白，称为bA4或或b蛋白。它是蛋白。它是b-淀粉前体蛋白淀粉前体蛋白（APP）的内源蛋白酶水解产物。）的内源蛋白酶水解产物。b蛋白的积累原因不蛋白的积累原因不详。详。在那些老年痴呆症患病频率较高的家庭成员中，在那些老年痴呆症患病频率较高的家庭成员中，APP基因上有突变。因此认为突变的基因上有突变。因此认为突变的APP基因

41、是该病基因是该病的病因。但是在人体中几乎无法研究该病的发生与发的病因。但是在人体中几乎无法研究该病的发生与发展过程。研究者们发现在小鼠的某些种系中产生老化展过程。研究者们发现在小鼠的某些种系中产生老化斑。而另一些种系则不产生。因此，后一种种系小鼠斑。而另一些种系则不产生。因此，后一种种系小鼠8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 32 可转基因的受体。将可转基因的受体。将APP基因转入鼠体内研究老年痴基因转入鼠体内研究老年痴呆症的分子机制。相应的载体也已构建出来。它包括呆症的分子机制。相应的载体也已构建出来。它包括一个来

42、自于脑特异性病毒的启动子区域，人一个来自于脑特异性病毒的启动子区域，人APP基因基因的一部分（编码的一部分（编码c末端末端100个氨基酸）。然后用此重组个氨基酸）。然后用此重组分子构建转基因鼠。并已确定转基因在脑神经元中表分子构建转基因鼠。并已确定转基因在脑神经元中表达。出现相应的症候群。但达。出现相应的症候群。但APP基因损伤的机制是什基因损伤的机制是什么，目前尚在研究中。么，目前尚在研究中。兔、猪、羊的转基因也获得了成功，但成功率较兔、猪、羊的转基因也获得了成功，但成功率较低，只有鼠的低，只有鼠的15%，平均每，平均每200个被注射的卵细胞仅有个被注射的卵细胞仅有一个能发育成转基因动物。转

43、生长素基因的猪生长期一个能发育成转基因动物。转生长素基因的猪生长期明显缩短，饲料利用率提高，廋肉比增加。明显缩短，饲料利用率提高，廋肉比增加。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 33(二）转基因牛二）转基因牛转基因牛主要目的是改善牛奶的组成：增加奶酪比转基因牛主要目的是改善牛奶的组成：增加奶酪比和降低乳糖的含量。牛奶中奶酪的含量与和降低乳糖的含量。牛奶中奶酪的含量与k-酪蛋白的酪蛋白的含量正相关。因此，通过含量正相关。因此，通过k-酪蛋白转基因的过量表达酪蛋白转基因的过量表达是增加牛奶是增加牛奶k-酪蛋白含量的理想途

44、径。同样，乳糖酶酪蛋白含量的理想途径。同样，乳糖酶转基因在乳腺中的表达能导致产生无乳糖牛奶，这种转基因在乳腺中的表达能导致产生无乳糖牛奶，这种牛奶深受那些对乳糖过敏或消化不良的人的欢迎。牛奶深受那些对乳糖过敏或消化不良的人的欢迎。转基因牛的另一目的是构建抗菌、抗病毒、抗寄转基因牛的另一目的是构建抗菌、抗病毒、抗寄生虫感染的新品种。原理是转抗体基因或转病毒细菌生虫感染的新品种。原理是转抗体基因或转病毒细菌蛋白基因，进行体内免疫。现在的大型养牛场控制感蛋白基因，进行体内免疫。现在的大型养牛场控制感染的方法是用疫苗免疫。药物医疗以及物理隔离，其染的方法是用疫苗免疫。药物医疗以及物理隔离，其成本是养牛

45、生产总成本的成本是养牛生产总成本的20%。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 34 转基因牛的构建方法：将转基因小鼠的转基因牛的构建方法：将转基因小鼠的DNA显显微注射技术稍加修改后即可用于构建转基因牛：微注射技术稍加修改后即可用于构建转基因牛：1)从屠宰场杀死的母牛体内收集卵母细胞从屠宰场杀死的母牛体内收集卵母细胞2)体外诱导牛卵母细胞体外诱导牛卵母细胞3)用公牛精子使卵母细胞体外受精用公牛精子使卵母细胞体外受精4)离心受精卵以除去卵黄（它的存在不利离心受精卵以除去卵黄（它的存在不利于用显微镜观察雄性原核）于用显微

46、镜观察雄性原核）5)将转基因显微注入雄性原核中将转基因显微注入雄性原核中6)体外培育受精卵至囊胚阶段体外培育受精卵至囊胚阶段7)将胚胎移植到处于发情期的母牛体内将胚胎移植到处于发情期的母牛体内8)在子代中检测转基因产物，每在子代中检测转基因产物，每2470个卵个卵细胞可获得两头转基因小牛细胞可获得两头转基因小牛.8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 35（三）其它转基因动物（三）其它转基因动物鸡的卵比较小，显微注射法不可用，主要是利用鸡的卵比较小，显微注射法不可用，主要是利用逆转录病毒感染受精卵的方法进行基因转移。转基

47、因逆转录病毒感染受精卵的方法进行基因转移。转基因鸡改造的主要是抗病性状。鸡改造的主要是抗病性状。鱼的转基因也已经获得了成功，鱼的卵排出体外，鱼的转基因也已经获得了成功，鱼的卵排出体外，易于收集，采用显微注射法，注射后易于收集，采用显微注射法，注射后35-80%存活率，存活率，总有效率总有效率10-70%。已经在鲤鱼、鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼。已经在鲤鱼、鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼上成功。将鲑鱼生长素上成功。将鲑鱼生长素cDNA与鳕鱼抗冻蛋白启动子及与鳕鱼抗冻蛋白启动子及polyA信号转化大西洋鲑鱼，使其体重明显增加。信号转化大西洋鲑鱼，使其体重明显增加。3.3 利用转基因动物生产生物大分子利用转基因动物生产

48、生物大分子用于生产生物大分子的转基因动物称为动物生物反应用于生产生物大分子的转基因动物称为动物生物反应器，或动物个体表达系统，具有广阔的应用前景。器，或动物个体表达系统，具有广阔的应用前景。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 36 现在建立转基因小鼠的技术已经成熟，可用作研究转现在建立转基因小鼠的技术已经成熟，可用作研究转基因大动物的一种模型。以建立转基因家畜，生产蛋基因大动物的一种模型。以建立转基因家畜，生产蛋白质或多肽类药物等生物大分子。白质或多肽类药物等生物大分子。a.动物生物反应器的组织选择动物生物反应器的组

49、织选择 作为动物生物反应器的器官或组织都选用乳腺。因为作为动物生物反应器的器官或组织都选用乳腺。因为乳汁可以连续分泌，流体含量丰足，频繁收集不会干乳汁可以连续分泌，流体含量丰足，频繁收集不会干扰动物正常的生理状态。转基因产物是在动物体内产扰动物正常的生理状态。转基因产物是在动物体内产生的异源蛋白。因此对人体不易产生免疫反应。另外，生的异源蛋白。因此对人体不易产生免疫反应。另外，动物乳汁中只有为数不多的十几种蛋白质，且其含量动物乳汁中只有为数不多的十几种蛋白质，且其含量及性质均已知。转基因产物的分离纯化十分方便。其及性质均已知。转基因产物的分离纯化十分方便。其优点简述为：优点简述为：1）含量丰富

50、，连续生产；）含量丰富，连续生产；2）对动物不对动物不构成危害；构成危害；3）转基因产物对人不易产生免疫反应；转基因产物对人不易产生免疫反应；4）分离纯化方便。分离纯化方便。8/2/2022 12:08 PM欢迎欢迎02级农业生物技术班同学们听课！级农业生物技术班同学们听课！Slide 37 目前已可在小鼠、家兔、绵羊和猪的乳汁中生产转基目前已可在小鼠、家兔、绵羊和猪的乳汁中生产转基因产物：乳铁蛋白、牛乳清蛋白、绵羊乳球蛋白、人因产物：乳铁蛋白、牛乳清蛋白、绵羊乳球蛋白、人的的t-PA、人、人IL-2、人、人 a-抗胰蛋白酶等。抗胰蛋白酶等。b.动物乳腺分泌转基因产物的研究模型动物乳腺分泌转基