专题四核酸鉴定技术教学课件.ppt

1、核酸鉴定技术专题四第1页，共75页。鉴定的内容 浓度和纯度 单一性 构型 目的分子 序列第2页，共75页。主要内容 核酸的物理化学性质 核酸的大小 核酸的构型 常规核酸的电泳检测技术 核酸分子杂交鉴定技术 经典DNA序列分析技术第3页，共75页。核酸的物理化学性质 紫外吸收：260nm 大小：从几个到1011nt 构型：超螺旋，解旋 序列：功能：第4页，共75页。核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。第5页，共75页。DNA钠盐的紫外吸收在260nm260nm附近有最大吸收值，其吸光率（Abs

2、orbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定性及定量测定。第6页，共75页。第7页，共75页。Purity of DNA A260/A280:dsDNA-1.8 pure RNA-2.0第8页，共75页。DNADNA或或RNARNA纯度的测定纯度的测定 对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值来确定，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的

3、A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有蛋白及苯酚等，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作准确的定量测定。第9页，共75页。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1gmL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD值（260nm）相当于50gmL双螺旋DNA，或40gmL单螺旋DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。第10页，共75页。1.

4、84第11页，共75页。通常，通常，含量：含量：1OD1OD260nm260nm=5050mg/ml mg/ml 双链双链DNADNA纯度：纯度：ODOD260nm260nm/OD/OD280nm280nm=1.81.8If If ODOD260nm260nm/OD/OD280nm280nm 1.81.8，ContaminatedContaminated by by?第12页，共75页。第13页，共75页。第14页，共75页。核酸的大小 生物基因组的大小显花类显花类两栖类两栖类支原体支原体第15页，共75页。迄今测出的最小的基因组科学家最近测出的两个细菌基因组两个细菌基因组如此之简单和小，它们

5、也许给自身的定位带来危机。日本和西班牙的研究小组测定了生活在其它生物内的“共生菌细菌基因组，其中一个可能将丧失它作为真正生物体的地位而成为其宿主细胞的一个部分，另一个看来正在走向灭绝。Carsonella ruddiiCarsonella ruddii是生活在吸食植物液昆虫身上的一种寄生细菌，它的基因组只有只有160160个个kbkb之长。过去的估计曾把最小的基因组定在400kb左右。虽然Carsonella基因组排得很满，有许多重叠的基因，而且几乎没有“废物”DNA，但是它没有许多被认为是生命不可缺少的基因。这些发现提出，Carsonella 也许进化成了昆虫细胞内的一个细胞器，宿主细胞补偿

6、了缺失的基因功能。Buchnera aphidicolaBuchnera aphidicola的基因组要大一点儿，约为约为420kb420kb。该细菌与其它几种细菌一样共生在一种蚜虫身上。与其它共生物种相比，B.aphidicola失去了许多能让它为宿主生存作出贡献的重要功能，这是好的共生体所需要做到的。其它的共生细菌看起来接管了这些功能。推测B.aphidicola 可能在走向灭绝。第16页，共75页。电泳鉴定DNA分子的大小 原理带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠化学惰性的介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形

7、状的差异，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。第17页，共75页。凝胶电泳分离生物大分子凝胶电泳分离生物大分子第18页，共75页。Agarose gel electrophoresis第19页，共75页。迁移率迁移率电泳的迁移率迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 第20页，共75页。DNADNA分子大小的估计分子大小的估计第21页，共75页。第22页，共75页。核酸构型第23页，共75页。凝胶电泳的分辨率分辨率：与凝胶的类型类型和密

8、度密度相关 琼脂糖凝胶的分辨率在0.250Kb之间;聚丙烯酰胺的分辨率在11000bp之间第24页，共75页。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。第25页，共75页。琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：TAE（TBE、TPE），1 x 凝胶的浓度：根据检测的DNA大小，1%DNA样品：40kb?40kb?=40kb=40kb?40kb?第36页，共75页。脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，

9、下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向移动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。第37页，共75页。第38页，共75页。第39页，共75页。核酸分子杂交鉴定技术核酸分子杂交鉴定技术核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在19681968年由华盛顿卡内基学院（年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Cavnegi

10、e Institute of WashingtonInstitute of Washington）的）的Roy BrittenRoy Britten及其同事发明的。所依据及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNADNA或或RNARNA，当它们混，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。第40页，共75页。杂种核酸分子：杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系。DNA/DNA或

11、RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某种特定基因的位置。第41页，共75页。核酸杂交常用几种膜的性核酸杂交常用几种膜的性能比较能比较第42页，共75页。硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片段。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。RNA变性后能十分容易的结合到膜上。第43页，共75页。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.1.核酸印迹转移：通常利用毛细作用将核酸样品转移到固体支持核酸印迹转移：通常利用毛细作用将核酸样品转移到固体支持膜上。膜上。2.2.印迹杂交：印迹杂交：将具有核

12、酸印迹的滤膜同带有标记的将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNADNA/RNA进进行杂交。行杂交。第44页，共75页。Southern Blot DNASouthern Blot DNA印迹杂交印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。第45页，共75页。印迹转移前的凝胶处理：印迹转移前的凝胶处理：分子量不同所需转移的时间不同；浸

13、泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤脱嘌呤，再进行 碱变性碱变性 碱水解，碱水解，DNADNA链断裂链断裂 单链单链第46页，共75页。（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝胶转移凝胶转移杂交技术杂交技术第47页，共75页。第48页，共75页。在进行核酸印迹转移的时：在进行核酸印迹转移的时：1.1.要将已转移好的硝酸纤维素膜在要将已转移好的硝酸纤维素膜在8080度下烘烤度下烘烤1 12 2小时；小时；2.2.紫外线交联法，紫外线交联

14、法，DNADNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。带正电荷的氨基基团之间进行交联。第49页，共75页。1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern RNA印迹技术（Northern blotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（

15、Western blotting）。第50页，共75页。斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的定量化的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。第51页，共75页。通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品,直接转移到适当的杂交滤膜上，然后按如同Southern或Northern 印

16、迹杂交一样的方式同核酸探针分子进行杂交。第52页，共75页。菌落杂交菌落杂交也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。主要用于鉴定重组子。第53页，共75页。检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术第54页，共75页。蛋白质蛋白质/DNA/DNA、蛋白质、蛋白质/RNA/RNA杂交技术杂交技术第55页，共75页。凝胶阻滞实验（凝胶阻滞实验（Gel retardation assayGel retardation assay）又叫又叫DNADNA迁移率变动实验（迁移率

17、变动实验（DNA mobility shift assayDNA mobility shift assay），是在，是在8080年代初期出现的用于在体外研究年代初期出现的用于在体外研究DNADNA与蛋白质相互与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定也是当前被选作分离纯化特定DNADNA结合蛋白质的一种典型的结合蛋白质的一种典型的实验方法。实验方法。原理：原理：DNADNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。第56页，共75页。第57页，共75页。凝胶

18、阻滞实验的基本原理图凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的放射性标记的DNADNA由于同一种细胞蛋白质由于同一种细胞蛋白质B B结合，于是在凝胶结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带第58页，共75页。不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定在与某一特定DNADNA片段结合的蛋白质分子片段结合的蛋白质分子 而且可以研究发生此种结合之精确的而且可以研究发生此种结合之精确的DNADNA序列的特异序列的特异性。（加入超量的非标记竞争性。（加入超量的非标记竞争DN

19、ADNA）第59页，共75页。在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争DNADNA与探针与探针DNADNA之间的竞争作用之间的竞争作用（a a）没有加入竞争）没有加入竞争DNADNA的正常的凝胶阻滞实验，探针的正常的凝胶阻滞实验，探针DNADNA与特异蛋白质结合，出与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（现阻滞条带；（b b）加入的超量竞争）加入的超量竞争DNADNA与探针与探针DNADNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带消失；（条带消失；（c c）竞争）竞争DNADNA与探针与探针DNADNA分别结合不同的蛋白质，出现同（分别结合不同的蛋白质，出现同（a a）一样的）一样的

20、阻滞条带。阻滞条带。第60页，共75页。可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。1.用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子2.在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。第61页，共75页。凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位。而足迹实验可以解决这个问题。第62页，共75页。足迹实验（足迹实验（footprinting assayfootprinting assay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。

21、足迹实验的一个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。第63页，共75页。第64页，共75页。如果使用较大的DNA片段，通过足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合单位的分布状况。如同凝胶阻滞实验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。第65页，共75页。硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMSDMS）足迹实验：）足迹实验：DMS能使裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶会对甲基化的G残基作特异的化学切割。而与蛋白结合的DNA片段上的G残基，不会被DMS甲基化，从而避开了六氢吡啶的切

22、割作用。于是在DNA片段的序列中，不存在这些G残基末端的DNA片段，出现了空白区。第66页，共75页。甲基化干扰实验（甲基化干扰实验（methyltion interference assaymethyltion interference assay）根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理，设计出了另一种研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法，即甲基化干扰实验。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性是，它只能使G残基甲

23、基化。尽管如此，它仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。具体操作如下页图所示。第67页，共75页。凝胶电泳凝胶电泳和和第68页，共75页。me硫酸二甲酯分离分离DNA并用并用六氢吡啶切割六氢吡啶切割第69页，共75页。DNA核苷酸序列分析（核苷酸序列分析（DNADNA测序）测序）第70页，共75页。传统的传统的DNADNA序列分析法：序列分析法：Sanger双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的新发展的DNADNA杂交测序法杂交测序法第71页，共75页。SangerSanger双脱氧链终止法原理：双脱氧链终止法原理：

24、双脱氧链终止法要求使用一种单链的单链的DNADNA模板模板和一种适当的DNADNA合成引合成引物物。利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准确的互补DNA链；第二，DNA聚合酶能够利用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3-末端，从而终止DNA链的延长。第72页，共75页。Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学分析法化学分析法19771977年由年由A.M.MaxamA.M.Maxam和和W.GilbertW.Gilbert发明。发明。原理：原理：用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。第73页，共75页。下一次课内容下一次课内容DNADNA的高通量测序的高通量测序第74页，共75页。OVER!第75页，共75页。