蛋白质与蛋白组学课件.ppt
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- 蛋白质 蛋白组 课件
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1、第三章第三章(一一)组成蛋白质的氨基酸种类组成蛋白质的氨基酸种类(amino acid AA)AA侧链侧链COO-H CNH3+R根据根据 R 不同不同将将20种种AA分为四类分为四类:非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸 非极性疏水性非极性疏水性AAAAAA的的R R侧链侧链是是脂肪烃脂肪烃或或芳香烃芳香烃-疏水基团。疏水基团。烃链越长疏水性越大。烃链越长疏水性越大。存在部位:常因相互疏水作用而处于存在部位:常因相互疏水作用而处于球状蛋球状蛋 白内部白内部或生物膜的或生物膜的跨膜双脂层中跨膜双脂层中。极性、中性极性、中性AA
2、(不解离极性不解离极性AAAA)AAAA的的R R侧链侧链是带有是带有极性的烃基极性的烃基、巯基巯基和和酰胺基团酰胺基团,故有,故有 亲水性,但不解离亲水性,但不解离.酸性酸性AA特点:特点:R R侧链侧链含有含有羧基羧基,可解离而带负电荷,可解离而带负电荷 -C-C上有一个羧基(上有一个羧基(COOCOO-)外,外,R R基上还基上还 含有一个含有一个羧基羧基.碱性碱性AA特点:特点:AAAA的的R R基基都含有碱性基团都含有碱性基团-有有氨基氨基、胍基胍基和和 咪唑基咪唑基,可解离而带正电荷。,可解离而带正电荷。酸性酸性AAAA和碱性和碱性AA-AA-解离的极性解离的极性AAAA 5 5种
3、种在蛋白质分子内在蛋白质分子内带正电荷的碱性带正电荷的碱性AAAA残基残基常与常与带负电荷的带负电荷的酸性酸性AAAA的残基的残基形成形成盐键盐键。存在部位:在蛋白质分子的表面,与环境中水分子形成存在部位:在蛋白质分子的表面,与环境中水分子形成 氢键。氢键。(二二)氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质+H+-H+-H+H+1.氨基酸是两性电解质氨基酸是两性电解质AAAA等电点等电点(isoelectric pH,pI)当溶液的当溶液的pHpH值达到某一特定值时,值达到某一特定值时,AAAA所所带带正负电荷相等正负电荷相等,AAAA分子分子净电荷为零净电荷为零,对外不显电,对外不显电性时溶液的性时溶
4、液的pHpH值称之。值称之。2.AA分子的水溶性分子的水溶性 AA由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度不同,据此将度不同,据此将AA分为:分为:亲水类:亲水类:Arg/Asp/Asn/Glu/Gln/Cys/Gly/His/Lys/Thr/Ser 疏水类:疏水类:Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Pro/Trp/Tyr/Val AA的侧链可以直接影响Pr或者多肽链的空间折叠方式。胞质蛋白中富含疏水氨基酸的构成肽段大多折叠于蛋白质分子的内部,而亲水氨基酸构成肽段则排列于蛋白质表面。3.部分部分AAAA有紫外吸收峰有紫外吸收峰 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨
5、酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸都有芳香环侧链,其中的共轭双都有芳香环侧链,其中的共轭双键可以在键可以在280nm的紫外线形成吸的紫外线形成吸收峰收峰,可作为分析样品中,可作为分析样品中Pr含量含量的方法。的方法。4.茚三酮反应茚三酮反应 茚三酮和茚三酮和-AA共热,共热,AA脱去其脱去其氨基和氨基和羧基,茚羧基,茚三酮被还原,产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三三酮被还原,产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物,在酮形成蓝紫色化合物,在570nm具吸收峰,由于吸光度具吸收峰,由于吸光度与与AA脱氨量有关,可据此测定脱氨量有关,可据此测定AA含量含量.5.成肽反应成肽反应 AA之间可
6、以通过之间可以通过氨基氨基和和羧基羧基脱水缩合形成酰胺结构,脱水缩合形成酰胺结构,连接的化学键叫做连接的化学键叫做肽键肽键(peptide bond)二、蛋白质分子的结构二、蛋白质分子的结构 蛋白质或多肽是蛋白质或多肽是AA的聚合体,氨基酸通过肽键的聚合体,氨基酸通过肽键连接形成肽连接形成肽(peptide)。)。肽平面肽平面:肽中肽中AA之间肽键的六个原子在同一平面,连接羧之间肽键的六个原子在同一平面,连接羧基的基的1碳原子和连接氨基的碳原子和连接氨基的2碳原子在对角位置碳原子在对角位置。Motif 模体结构域 Pr的二级结构(的二级结构(secondary structure):):Pr分
7、子中某一段肽链的局部空间结构,即该段肽链的主链骨分子中某一段肽链的局部空间结构,即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置,不涉及架原子的相对空间位置,不涉及AA侧链的构象侧链的构象 化学键:化学键:H H 键键 螺旋螺旋(helix)折叠折叠(sheet)转角转角(turn)无规卷曲无规卷曲(random coil)蛋白质的一级结构(蛋白质的一级结构(primary structure):肽链中肽链中AA残基(残基(residue)的排列次序。)的排列次序。化学键:化学键:肽键、二硫键肽键、二硫键空间结构的折叠需要分子伴侣的参与空间结构的折叠需要分子伴侣的参与螺旋结构螺旋结构折叠折叠转角转角转角
8、1与3氨基酸残基之间形成氢键。17蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构超二级结构(supersecondary structure(supersecondary structure)*:由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。是特殊的序列或结构的基本组成单元,又称是特殊的序列或结构的基本组成单元,又称基序基序或或模序模序(motif)motif)*.可进一步组建成可进一步组建成结构域。结构域。超二级结构超二级结构包括:包括:、组合。组合。钙结合蛋白中结合钙离子钙结合蛋白中结合钙离子的模序的模序锌指结构蛋白质的三级
9、结构蛋白质的三级结构tertiary structure 一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置 化学键:氢键、疏水作用、离子键、范德华力化学键:氢键、疏水作用、离子键、范德华力结构域结构域(domain):在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成半独立较紧密的球状结构,半独立较紧密的球状结构,具有简单的生物学功能。具有简单的生物学功能。结构域是多肽链的一个结构域是多肽链的一个部分部分,它们可用限制性蛋白它们可用限制性蛋白酶从多肽链上切割下来而酶从多肽链上切割下来而不改变其性质。不改变其性质。结构域的组合就形成结构域的组
10、合就形成了了Pr的完整三级结构。的完整三级结构。催化结构域NADNAD+结合结构域结合结构域19 结构域有两个重要的功能结构域有两个重要的功能*:第一,像亚基那样,能作为一个第一,像亚基那样,能作为一个来有效地参与来有效地参与 蛋白质分子的装配。蛋白质分子的装配。独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘 曲过程简化为个别的简单步骤。曲过程简化为个别的简单步骤。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。第二,结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及第二,结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及 巨大结构
11、的装配具有决定作用。巨大结构的装配具有决定作用。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 蛋白质四级结构(蛋白质四级结构(quaternary structurequaternary structure)指)指的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局 化学键:化学键:各亚基之间主要靠各亚基之间主要靠疏水作用疏水作用相互结合,相互结合,氢键氢键、离子键和范得华力离子键和范得华力也参与四级结构的维持。也参与四级结构的维持。亚基(亚基(subunitsubunit):):蛋白质四级结构中蛋白质四级结构中独立结构的肽链独立结构的肽链 四级结构的蛋白质,单四级结构的蛋白质
12、,单独的亚基没有生物活性独的亚基没有生物活性三、蛋白质分子结构和功能的关系三、蛋白质分子结构和功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础蛋白质一级结构是空间结构的基础 特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链侧链R R基团形成的次级键来维持基团形成的次级键来维持u一级结构相似的蛋白质,其构象及功能也相似一级结构相似的蛋白质,其构象及功能也相似 促肾上腺皮质激素促肾上腺皮质激素(ACTH)(ACTH)和促黑激素和促黑激素(MSH)(MSH)均均 为垂体分泌的多肽激素。为垂体分泌的多肽激素。ACTH 4ACTH 41010位的氨基酸结构与位的氨基酸结构与M
13、SHMSH的的11111717位一样,故位一样,故ACTHACTH有较弱的有较弱的MSHMSH的生理作用的生理作用u Pr一级结构中参与功能活性的残基一级结构中参与功能活性的残基(关键部位关键部位),发生异常改变其功能发生异常改变其功能 镰状镰状RBCRBC贫血贫血(GluVal)(GluVal)22镰刀型红细胞性贫血:镰刀型红细胞性贫血:*仅发生在一级结构中:仅发生在一级结构中:6Glu换成换成6Val 由此引起:由此引起:三级结构多一疏水键,三级结构多一疏水键,四级结构发生线性缔合四级结构发生线性缔合结果:导致红细胞发生溶血结果:导致红细胞发生溶血蛋白质的功能与其空间构象密切相关蛋白质的功
14、能与其空间构象密切相关 构象发生变化,其功能活性也随之改变:构象发生变化,其功能活性也随之改变:在生物体内,当某种物质特异地与蛋白质分子的在生物体内,当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合,触发该蛋白质的构象发生一定变化,从某个部位结合,触发该蛋白质的构象发生一定变化,从而导致其功能活性的变化,这种现象称为而导致其功能活性的变化,这种现象称为蛋白质的别构蛋白质的别构效应效应(allosteric effect)(allosteric effect)。如:寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象,这种构如:寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象,这种构象的变化传递可影响其他的亚基构象,
15、进而改变了分子的生物学象的变化传递可影响其他的亚基构象,进而改变了分子的生物学活性。活性。协同作用协同作用-各亚基之间的相互作用各亚基之间的相互作用 是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。正协同效应:正协同效应:如果如果1 1个亚基和配体结合,使另个亚基和配体结合,使另1 1个亚个亚 基与配体的结合更容易了基与配体的结合更容易了 负协同效应负协同效应:若亚基结合的配体相同,为同种协同:若亚基结合的配体相同,为同种协同 效应,如配体不同则为异种协同效应效应,如配体不同则为异种协同效应蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现在两方面:蛋白质的结构与功能之间的关系主
16、要表现在两方面:1.1.蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。蛋白质的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。2.2.蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重 要保证。要保证。四、蛋白质的理化性质四、蛋白质的理化性质(一一)蛋白质的两性解离蛋白质的两性解离 蛋白质除了蛋白质除了N N端的氨基和端的氨基和C C端的羧基可以解端的羧基可以解离外,侧链中的某些基团在一定离外,侧链中的某些基团在一定pHpH环境下也可环境下也可以解离以解离 蛋白质分子所带电荷状况决定于特定蛋白质分子所带电荷状况决定于特定pHpH环环境下所有氨基酸残基可解离集团的
17、的荷电情况境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电情况。蛋白质的等电点蛋白质的等电点(pI):):当蛋白质分子在某一当蛋白质分子在某一pH值的溶液中解离成值的溶液中解离成正、负离子的趋势相等,成为兼性离子,净电正、负离子的趋势相等,成为兼性离子,净电荷为零时溶液的荷为零时溶液的pH值值(二二)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质分子具有胶粒蛋白质分子具有胶粒(0.001(0.0010.10.1m)m)的特性。的特性。其溶液稳定原因:其溶液稳定原因:1.1.表面常是亲水表面常是亲水AAAA,可以结合水分子在蛋白,可以结合水分子在蛋白 质表面形成一层质表面形成一层水化膜水化膜,从而阻断蛋白质,从而
18、阻断蛋白质分分 子相互靠近聚集,防止蛋白质析出。子相互靠近聚集,防止蛋白质析出。2.2.由于蛋白质带有电荷,由于蛋白质带有电荷,同种电荷相互排斥同种电荷相互排斥 使得蛋白质不能聚集。使得蛋白质不能聚集。(三三)蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固 变性:变性:在某些理化因素作用下,在某些理化因素作用下,PrPr空间构象被破坏从而空间构象被破坏从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失导致其理化性质的改变和生物活性的丧失-蛋白质的蛋白质的变性(变性(denaturationdenaturation)。)。主要破坏二硫键和次级键,不涉及肽键。主要破坏二硫键和次级键,不涉及肽键。加热、乙醇
19、等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以加热、乙醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以使蛋白质发生变性。使蛋白质发生变性。复性:复性:蛋白质变性如果程度较轻,在去除变性因素后蛋白质变性如果程度较轻,在去除变性因素后恢复或者部分恢复其原有的构象和功能恢复或者部分恢复其原有的构象和功能-复性复性 (renaturationrenaturation)蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱溶液中,将溶液中,将pHpH值调至等电点时,变性蛋白质立即变成值调至等电点时,变性蛋白质立即变成絮状物,此絮状物仍可以溶解于强酸强碱溶液中,再絮状物,此絮状物仍可以溶解于强酸强碱
20、溶液中,再加热时絮状物变为坚固的凝块,此凝块不再溶于强酸加热时絮状物变为坚固的凝块,此凝块不再溶于强酸强碱,称为强碱,称为蛋白质的凝固蛋白质的凝固(coagulationcoagulation)蛋白质的沉淀、凝固蛋白质的沉淀、凝固 变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶液中析出的现象液中析出的现象-蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀。(四)蛋白质的紫外吸收 蛋白质含有芳香族氨基酸,在蛋白质含有芳香族氨基酸,在280nm280nm处有吸收峰。处有吸收峰。在一定范围内在一定范围内,蛋白质溶液浓度与蛋白质溶液浓度与A280nmA280nm成正成正比。(五)蛋白质的呈色反应 P
21、rPr水解产生水解产生AAAA也可发生也可发生茚三酮显色反应茚三酮显色反应 PrPr在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或 者红色,称为者红色,称为双缩脲反应双缩脲反应。(一一)透析透析(dialysis)及超滤及超滤原理原理:利用利用Pr不能透过半透膜而将不能透过半透膜而将Pr与小分子物质分开与小分子物质分开截留分子量的超滤膜(正压或离心截留分子量的超滤膜(正压或离心)半透膜半透膜五、蛋白质的分离纯五、蛋白质的分离纯化化(二二)常用沉淀方法常用沉淀方法1.盐析盐析(salt precipitation)原理原理-将(将(NH)2SO4、Na2SO4、
22、NaCl等加入蛋白质溶液,破等加入蛋白质溶液,破 坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。2、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀(1)原理:极性较大有机溶剂破坏)原理:极性较大有机溶剂破坏pr水化层导致水化层导致Pr沉淀析出;沉淀析出;(2)04,丙酮,丙酮10倍于倍于Pr溶液体积,尽快操作,防止变性。溶液体积,尽快操作,防止变性。3.免疫沉淀免疫沉淀 Pr具有抗原性,用特异抗体形成免疫复合物,沉淀分离具有抗原性,用特异抗体形成免疫复合物,沉淀分离(三三)电泳(电泳(electrophoresis):蛋白质在高于或低于蛋白质在高于或低于其其p
23、IpI的溶液中是带电的,的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极在电场中能向电场的正极或负极移动。或负极移动。电泳:电泳:通过蛋白质在电场通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。白质的技术。分类:分类:纸电泳纸电泳 凝胶电泳凝胶电泳 等等 (四)应用相分配或亲和原理(四)应用相分配或亲和原理-层析层析 分离分离 (chromatography)层析也叫色谱是分离蛋白质常用的方法:当蛋白质溶液(流动相)经过一个固态物质(固定相)时,待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少、亲和力差异等不断将蛋白质在固定相中重新分配,并且以不同速度流经固定相。层析法分离、纯化层析法分离、纯化
24、:Pr、多肽和多肽和AA 蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负电荷的蛋白质成分就与固定相结合,而带正电荷的成电荷的蛋白质成分就与固定相结合,而带正电荷的成分则完全通过固定相,进一步用带负电荷的溶液(如分则完全通过固定相,进一步用带负电荷的溶液(如ClCl-)洗脱固定相就可以得到蛋白质。)洗脱固定相就可以得到蛋白质。离子交换层析离子交换层析-阳离子交换层析阳离子交换层析 (阴离子交换层析)(阴离子交换层析)依据:依据:PrPr和和AAAA一样,是两性电解质,在某一一样,是两性电解质,在某一 特定特定pHpH时,各蛋白质的电荷量及性质不同。时,各蛋白
25、质的电荷量及性质不同。35固定相:固定相:1.1.纤维素纤维素-DEAE DEAE纤维素、纤维素、CMCM纤维素纤维素2.2.葡聚糖葡聚糖 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)(gel filtration)(分子筛)(分子筛)原理原理:层析柱中填满带有小孔的颗层析柱中填满带有小孔的颗粒(一般由葡聚糖制成)。粒(一般由葡聚糖制成)。PrPr溶溶液加于柱的顶部,任其往下渗漏,液加于柱的顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子柱中滞留时间较长,大分子PrPr不不能进入孔内而径直流出,因而不能进入孔内而径直流出,因而不同大小的同
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