定量分析样品的前处理课件.ppt

1、1 第四章第四章药物定量分析与分析方法验证药物定量分析与分析方法验证2定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法定量分析方法的特点定量分析方法的特点药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求3第一节第一节 定量分析样品的前处理方法定量分析样品的前处理方法 采用一定的方法采用一定的方法,使待测药物或待测元素转使待测药物或待测元素转化为适宜的状态后化为适宜的状态后,再进行分析测定。再进行分析测定。分析样品前处理分析样品前处理前处理对象前处理对象1.1.含卤素元素（含卤素元素（F F、ClCl、BrBr、I I）2.2.金属元素（金属元

2、素（CaCa、FeFe、HgHg、ZnZn、Sn Sn、Bi)Bi)3.3.含含AsAs、P P、S S等元素等元素4.4.生物样本生物样本4前处理样品分类前处理样品分类有机卤素药物有机卤素药物1.1.卤素与脂肪链的碳原子相连卤素与脂肪链的碳原子相连-结合不牢固结合不牢固 1.1.金属离子不直接与碳原子相连金属离子不直接与碳原子相连,在溶液中可直在溶液中可直接离解出金属离子接离解出金属离子。-含金属有机药物含金属有机药物 2.2.金属离子直接与碳原子以共价键相连金属离子直接与碳原子以共价键相连.结合状结合状态比较牢固态比较牢固,在溶液中不能直接离解出金属离子在溶液中不能直接离解出金属离子。-有

3、机金属药物有机金属药物含金属有机药物含金属有机药物2.2.卤素与芳环相连卤素与芳环相连-结合牢固结合牢固5 根据卤素或金属在分子中结合牢固程度不同处根据卤素或金属在分子中结合牢固程度不同处理方法而异理方法而异。不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法经有机破坏的分析方法直接测定法直接测定法经水解后测定法经水解后测定法经氧化还原后测经氧化还原后测定法定法湿法破坏法湿法破坏法干法破坏法干法破坏法氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法前前处处理理方方法法8卤素结合于芳环上卤素结合于芳环上,由于分子碘的结合较牢固由于分子碘的结合较牢固,需在需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）碱性溶液中加还原剂（如锌

4、粉）,加热回流加热回流,使碳使碳-碘键断裂碘键断裂,形成无机碘化物后测定。形成无机碘化物后测定。(三三)经氧化还原后测定法经氧化还原后测定法（1 1）碱性还原后测定）碱性还原后测定如如:泛影酸（卤素原子与芳环相连泛影酸（卤素原子与芳环相连,化学键牢固）化学键牢固）9COOHINHCOCH3ICH3COHNI NaOH加热回流COONaNH2H2N+3NaI+2CH3COONa+3Na2ZnO2+3H2O Zn粉粉NaI+AgNO3 AgI +NaNO3曙红钠为吸附指示剂曙红钠为吸附指示剂黄色黄色玫瑰红色玫瑰红色10硝酸硝酸-高氯酸法高氯酸法1.1.湿法破坏法湿法破坏法 破坏力强破坏力强,不适于

5、含氮杂环，不适于含氮杂环，适用于血、尿、组适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子到的无机金属离子,一般呈高价态。一般呈高价态。硝酸硝酸-硫酸法硫酸法 适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。机金属离子均为高价态。不能用于含碱土金属有机不能用于含碱土金属有机药物的破坏。药物的破坏。v有机破坏方法有机破坏方法11硫酸硫酸-硫酸盐法硫酸盐法 本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化

6、破坏能力，且防止硫提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。酸的分解损失。34244442)(SOHN42NHSONHHSONHNaOHSOH 药药物物含含碱碱滴滴定定酸酸吸吸收收液液吸吸收收/凯氏定氮法凯氏定氮法12H H2 2SOSO4 4：氧化剂和炭化剂。消解一般在通风橱中进行。氧化剂和炭化剂。消解一般在通风橱中进行。K K2 2SOSO4 4：提高提高H H2 2SOSO4 4沸点，沸点，缩短消解时间缩短消解时间CuSOCuSO4 4：催化剂，使消解速度加快催化剂，使消解速度加快消解产物：消解产物：(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NHNH4 4HSOHSO

7、4 4131.1.取样量取样量:含金属元素在含金属元素在10 10 100100 g g范围内范围内,取样取样1010g g；生物样品；生物样品血血1010 15ml;15ml;尿尿50ml50ml2.2.所用仪器凯氏烧瓶所用仪器凯氏烧瓶3.3.空白试验空白试验4.4.通风橱中进行通风橱中进行 注意事项注意事项14 2.2.干法破坏干法破坏 适用于含卤素、适用于含卤素、S S、P P等有机药物分析的前处理，等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中也用于某些药物中SeSe及砷盐的检查。及砷盐的检查。（1 1）高温炽灼法）高温炽灼法l将有机物置坩埚内将有机物置坩埚内,灼烧灰化以达到分解目的。灼烧灰

8、化以达到分解目的。l 加无水加无水Na2CO3Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或、硝酸镁、氢氧化钙或ZnOZnO以助灰以助灰化。化。15（2 2）氧瓶燃烧法）氧瓶燃烧法 氧瓶燃烧法是将有机药物放入氧瓶燃烧法是将有机药物放入充满氧气充满氧气的的密闭密闭烧瓶烧瓶中进行中进行燃烧燃烧,并将燃烧所产生的欲测物质（气态）并将燃烧所产生的欲测物质（气态）吸收吸收于适当吸收液中于适当吸收液中,然后根据欲测物质的性质然后根据欲测物质的性质,采采用适当分析方法进行鉴别、检查或含量测定。用适当分析方法进行鉴别、检查或含量测定。测测定定吸吸收收无无机机离离子子有有机机药药物物、含含吸吸收收液液、燃燃烧烧 2OSePS

9、X16特点：特点：快速分解有机药物的简单方法。快速分解有机药物的简单方法。不需复杂设备不需复杂设备,能使有机结合中的待测元素定能使有机结合中的待测元素定量地分解成无机离子状态。量地分解成无机离子状态。适用于含适用于含卤素及硫、磷、硒卤素及硫、磷、硒等等药物的鉴别、检药物的鉴别、检查和含量测定查和含量测定,特别适用于微量样品的测定。特别适用于微量样品的测定。17仪器装置仪器装置18 容量大小随样品量而定容量大小随样品量而定,一般一般500ml500ml、1000ml1000ml。含氟药物含氟药物用石英制或聚氯乙烯制的燃烧瓶用石英制或聚氯乙烯制的燃烧瓶,因样品燃烧后因样品燃烧后,产生产生HF,HF

10、,对玻璃有腐蚀作用对玻璃有腐蚀作用,与玻与玻璃中的硼生成氟化硼璃中的硼生成氟化硼,BF,BF3 3在水中不能完全解离在水中不能完全解离,而使测定结果偏低。而使测定结果偏低。硬质玻璃碘瓶硬质玻璃碘瓶19 铂丝下端做成螺旋状铂丝下端做成螺旋状,长度约为瓶身的长度约为瓶身的2/32/3。铂丝作用：铂丝作用：a a 固定样品固定样品 b b 催化使样品分解完全催化使样品分解完全 瓶塞底部熔封一根铂丝瓶塞底部熔封一根铂丝20加吸收液通氧加吸收液通氧燃烧燃烧吸收吸收测定测定取样取样10-20mg10-20mg适宜方法测定吸收液吸收于燃烧产物燃烧样品/PtO2操作操作21 充氧气要充分充氧气要充分 使样品燃

11、烧完全使样品燃烧完全,一般急速通氧气一般急速通氧气1212分钟分钟,燃烧燃烧完全时没有黑色炭化物。完全时没有黑色炭化物。注意事项注意事项吸收完全吸收完全 一般振摇一般振摇30,30,燃烧瓶看不到烟雾。燃烧瓶看不到烟雾。ClCl、F F白色烟雾白色烟雾 BrBr棕色棕色 I I紫色紫色防爆防爆 样品燃烧时样品燃烧时,温度很高温度很高,燃烧瓶内压力很大燃烧瓶内压力很大,有爆有爆炸的可能性炸的可能性,必须采取防护措施。必须采取防护措施。22氟化物、氯化物氟化物、氯化物OHCOXPt/OXR222 氟或氯以离子状态氟或氯以离子状态存在存在,吸收后可直接测定吸收后可直接测定.吸收液的选择吸收液的选择23

12、溴化物或碘化物溴化物或碘化物,燃烧后以多种价态存在燃烧后以多种价态存在,吸收吸收后应转化为统一价态再测定后应转化为统一价态再测定.碘化物碘化物OHCOIOIIPt/OIR22322量少量极少量大OHCOBrBrPt/OBrR2222量少量大溴化物溴化物24l测量含溴药物，可在水测量含溴药物，可在水-氢氧化钠吸收液中中加氢氧化钠吸收液中中加入还原剂二氧化硫饱和溶液。入还原剂二氧化硫饱和溶液。l测量含碘药物，可在水测量含碘药物，可在水-氢氧化钠吸收液中中加氢氧化钠吸收液中中加入入溴溴-醋酸溶液醋酸溶液。25问题：问题：如何选择含硫、磷药物的吸收液？如何选择含硫、磷药物的吸收液？26燃烧燃烧吸收吸收

13、加溴加溴加甲酸加甲酸加加KI KI 滴定滴定 实例实例-碘苯酯的含量测定碘苯酯的含量测定 淀粉作指示剂 终点：蓝色消失 样品 0.02mol/L Na2S2O3 O2/Pt 燃烧 NaOH-H2O 吸收 Br2-HAc 甲酸 空气 KI 27 将将 -氧化为氧化为 O O3 3 2Na 2Na+Br+Br2 2=2NaBr+=2NaBr+2 2 2 2+5Br+5Br2 2+6H+6H2 2O=2HO=2HO O3 3 +10HBr+10HBr22COHBrHCOOHBr2 2 溴溴-醋酸氧化剂：醋酸氧化剂：2 2+2Na2S+2Na2S2 20 03 3 2HNa 2HNa +Na+Na2

14、2S S4 40 03 34 4 加加KI KI 滴定滴定 K K +O O3 3 3 3 2 2+H+H2 2O OR-R-CO CO2 2+H+H2 2O+O+NaNa+Na+NaO O3 31 1 燃烧燃烧吸收吸收O O3 3 加甲酸：除去过量的溴加甲酸：除去过量的溴NaOHNaOH28第二节第二节 定量分析方法的特点定量分析方法的特点一、容量分析法一、容量分析法（一）容量分析法的特点（一）容量分析法的特点优点优点:准确度较高（相对误差不大于准确度较高（相对误差不大于0.2%0.2%）、精密）、精密度好、仪器设备简单、实验成本低、操作简便、度好、仪器设备简单、实验成本低、操作简便、快速。

15、快速。缺点：缺点：专属性不高。专属性不高。适用性：适用性：多用于原料药的含量测定多用于原料药的含量测定292.2.滴定度的计算滴定度的计算 aAaA（待测物）（待测物）+bB bB（滴定液）（滴定液）cC cC+dD dD a ba b T/M 1m T/M 1m T=ma/bMm m：滴定液浓度：滴定液浓度 (mol/L)(mol/L)M M：被测物分子量：被测物分子量1.1.滴定度（滴定度（T T）：）：每每1ml1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量量(mg)(mg)（二）容量分析法的计算（二）容量分析法的计算30 3.3.百分含量的计算百分含量的计

16、算（1 1）直接滴定法）直接滴定法W W：供试品取样量：供试品取样量 设至终点时，消耗滴定液体积为设至终点时，消耗滴定液体积为V ml则药物实测质量为则药物实测质量为VT供试品取样量供试品取样量实测药物质量实测药物质量含量含量100WTFV100 浓度校正因数浓度校正因数规定规定实际实际CCF31例例:司可巴比妥钠的含量测定司可巴比妥钠的含量测定:取本品取本品0.1g,0.1g,置置250mL250mL碘量瓶中碘量瓶中,加水加水10mL,10mL,振摇溶解振摇溶解,精密加溴滴定液精密加溴滴定液(0.05mol/L)25mL,(0.05mol/L)25mL,再加盐酸再加盐酸5mL,5mL,密塞密

17、塞,暗处放置暗处放置15min,15min,加碘化钾试液加碘化钾试液10mL,10mL,摇匀摇匀,用硫代硫酸钠用硫代硫酸钠(0.1mol/L)(0.1mol/L)滴定滴定,做空白校正做空白校正.已知已知:司可巴比妥钠司可巴比妥钠M=260.23;M=260.23;司可巴比妥钠与溴反司可巴比妥钠与溴反应的摩尔比为应的摩尔比为1:1,1:1,；供试品的称取量；供试品的称取量W=0.1022g,W=0.1022g,硫硫代硫酸钠代硫酸钠(0.1mol/L)(0.1mol/L)浓度校正因子浓度校正因子F=1.038;F=1.038;供试品供试品滴定消耗硫代硫酸钠滴定消耗硫代硫酸钠15.73ml15.73

18、ml；空白试验消耗硫代硫；空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液酸钠滴定液23.21ml23.21ml。计算：溴滴定液（计算：溴滴定液（0.05mol/L0.05mol/L）的滴定度）的滴定度3202 2 32 2 32()%100%(23.21 15.73)1.038 13.01100%0.1022 100098.8%s Na S ONa S OBrV VFTW司 可 巴 比 妥 含 量（）210.05260.2313.011BrT 33（2 2）间接滴定法）间接滴定法 1 1）生成物滴定法）生成物滴定法 药物药物 +A B +A B 滴定滴定 2 2）剩余滴定法（回滴法）剩余滴定法（回滴法）药物药物

19、 +A+A（定、过量）（定、过量）剩余的剩余的 A+B A+B （回滴）（回滴）V V 空白试空白试验验VV0 0滴定剂滴定剂）（含量含量100WFTVV0 34（一）紫外（一）紫外可见分光光度法可见分光光度法二二.光谱分析法光谱分析法2.2.原理：原理：根据根据LambertBeerLambertBeer定律定律 A=ECLA=ECL E E：吸收系数：吸收系数 C:C:单位浓度单位浓度 L:L:液层厚度液层厚度1.1.特点：特点：（1 1）灵敏度高，可达）灵敏度高，可达1010-4-4 g/ml g/ml1010-7-7 g/ml g/ml （2 2）准确度高，相对误差为）准确度高，相对误

20、差为2%2%5%5%（3 3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及35摩尔吸收系数（摩尔吸收系数（）：指在一定波长下）：指在一定波长下,溶液浓溶液浓度为度为1mol/L1mol/L，厚度为，厚度为1 1时的吸收度。时的吸收度。百分吸收系数（百分吸收系数（）：指在一定波长下）：指在一定波长下,溶溶液浓度为液浓度为1%1%（W/VW/V），厚度为），厚度为1 1的吸收度。的吸收度。.%11Ecm与与E E关系关系 强吸收度：强吸收度：=10=104 4 10105 5 弱吸收度：弱吸收度：10100100%11Ecm42mLgmLgCi/1045.2100/104

21、5.21207507.053mLgC/1050.2100101001050.252样%0.98%1001050.21045.2%100%5512样CCBi43差示分光光度法差示分光光度法双波长分光光度法双波长分光光度法三波长分光光度法三波长分光光度法（3 3）计算分光光度法）计算分光光度法（4 4）比色法）比色法 特点：特点：加入显色剂后，按照对照品比较法测定，影响加入显色剂后，按照对照品比较法测定，影响显色因素很多，故需注意平行操作。显色因素很多，故需注意平行操作。44(二二)荧光分析法荧光分析法 原理：物质在受到激发光（原理：物质在受到激发光（exex）照射后产生）照射后产生了较长波长的荧

22、光（了较长波长的荧光（emem）。）。溶液的溶液的荧光强度荧光强度和溶液的和溶液的吸光程度吸光程度、溶液中、溶液中荧光荧光物质的荧光效率物质的荧光效率等因素有关。等因素有关。45(2)(2)特点特点灵敏度高灵敏度高,可达可达1010-10-10g/mlg/ml10-10-1212g/ml.g/ml.多在低浓度进行多在低浓度进行.应用范围窄应用范围窄.取样少取样少,方法快速方法快速.46(3)(3)含量测定：含量测定：对照品比较法对照品比较法对对对空白对空白对对供空白供空白供供供供CRRRRC 47 说明说明a.a.药物本身无荧光：药物本身无荧光：加衍生试剂（荧胺、邻苯二甲醛（加衍生试剂（荧胺、

23、邻苯二甲醛（OPAOPA）丹酰）丹酰氯）氯）,使成荧光物质后测定。使成荧光物质后测定。b.b.荧光测定影响因素多：荧光测定影响因素多：溶剂、溶剂、pHpH值、散射光、荧光物质浓度值、散射光、荧光物质浓度故做空白试验，不易测得绝对荧光强度。故做空白试验，不易测得绝对荧光强度。48高效液相色谱法高效液相色谱法基本原理基本原理1.1.定义：定义：三、色谱分析法三、色谱分析法（一）高效液相色谱法（一）高效液相色谱法2.2.液相色谱分离原理液相色谱分离原理 根据各组分在固定相及流动相中的根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力吸附能力、分分配系数配系数、离子交换作用离子交换作用或或分子尺寸大小分子尺寸大小

24、的差异进行的差异进行分离。分离。色谱分离实质是样品分子与溶剂以及固定相分子色谱分离实质是样品分子与溶剂以及固定相分子间的作用。间的作用。493.3.基本术语基本术语保留时间和调整保留时间保留时间和调整保留时间tR 50保留因子保留因子 是溶质在固定相中的分子数与流动相中的分是溶质在固定相中的分子数与流动相中的分子数的比率。子数的比率。分离度分离度R22112WWttRRR峰宽和之半）保留值之差（峰顶间距分离因子分离因子 又称选择性。又称选择性。=2/1=2/151理论塔板数理论塔板数 经典的色谱理论将色谱分离过程看作一系列经典的色谱理论将色谱分离过程看作一系列相继的平衡过程，每一平衡过程称之为

25、一个理论塔相继的平衡过程，每一平衡过程称之为一个理论塔板，即把色谱柱假象成由许多板组成，在每一板上，板，即把色谱柱假象成由许多板组成，在每一板上，成分在两相间建立一次平衡。成分在两相间建立一次平衡。2212)(54.5)(16WtWtnRReff52峰不对称性峰不对称性T 峰不对称性在药典中称拖尾因子峰不对称性在药典中称拖尾因子T。T=105.02dWh（T=0.951.05）拖尾：拖尾：某些分子与固定相分子由于氢键等分子间某些分子与固定相分子由于氢键等分子间作用力而强烈保留，这些分子将落后于主峰，成作用力而强烈保留，这些分子将落后于主峰，成为谱峰尾部。为谱峰尾部。前伸：前伸：由于某些分子因固

26、定相对其较少保留而移由于某些分子因固定相对其较少保留而移向主峰带之前。向主峰带之前。53高效液相高效液相色谱仪由色谱仪由 高压输液高压输液系统、进系统、进样系统、样系统、分离系统、分离系统、检测系统、检测系统、记录系统记录系统 等五大部等五大部分组成。分组成。4.4.组成组成54流动相流动相真空脱气机真空脱气机四元泵四元泵自动进样器自动进样器紫外检测器紫外检测器荧光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器55自动进样器自动进样器56四元泵四元泵57色谱柱色谱柱填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶5859606162636.6.高效液相色谱的固定相和流动相高效

27、液相色谱的固定相和流动相 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力以承受高压能力来分类，来分类，可分为可分为刚性固体和硬胶刚性固体和硬胶两大类。两大类。1.1.刚性固体刚性固体:以以二氧化硅二氧化硅为基质为基质,可承受可承受7.07.0 10108 8 1.01.0 10109 9PaPa的高压，可制成直径、形状、的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。一种固定相。v固定固定相相64硅胶填料硅胶填料：硅胶为基质的

28、填料：硅胶为基质的填料HPLCHPLC中用的最为普中用的最为普遍遍.优点：优点：1.1.机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床，机械强度好，可以填充成稳定、高效的填充床，在长期高压操作下不变形，柱寿命长。在长期高压操作下不变形，柱寿命长。2.2.比其它材料的柱有更高的柱效。比其它材料的柱有更高的柱效。缺点：缺点：1.1.高高PHPH值下会溶解，值下会溶解，PHPH8 8时会溶解崩床。时会溶解崩床。2.2.表面酸性表面酸性65键合硅胶：键合硅胶：许多键合相填料是由下述反应制备的许多键合相填料是由下述反应制备的单体结构。单体结构。SiOH+Cl-Si（CH3）2RSiOSi（CH3）2R正正-十

29、八硅烷键合相制成的色谱柱十八硅烷键合相制成的色谱柱（ODSODS，C18C18）庚烷键合相制成的色谱柱庚烷键合相制成的色谱柱（C8C8）氰丙基二甲基硅烷键合相制成的色谱柱称为氰丙基二甲基硅烷键合相制成的色谱柱称为氰基柱氰基柱丙氨基硅烷键合相制成的色谱柱称为丙氨基硅烷键合相制成的色谱柱称为氨基柱氨基柱66 硅胶基质键合相硅胶基质键合相的稳定性与硅胶和键合相类型、的稳定性与硅胶和键合相类型、流动相流动相PHPH、缓冲盐及有机溶剂性质有关。、缓冲盐及有机溶剂性质有关。温度的增温度的增高、高、PHPH值的降低、流动相中含水量的提高值的降低、流动相中含水量的提高会使硅胶会使硅胶上的上的Si-O-SiSi

30、-O-Si键水解，因而使键合相流失。键水解，因而使键合相流失。优点：优点：柱效高柱效高缺点：缺点：对流动相对流动相PHPH值范围及组成有一定限制（通常值范围及组成有一定限制（通常为为PH=2PH=28 8）。）。672.2.硬胶主要用于硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中离子交换和尺寸排阻色谱中，它，它由由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力。可承受压力上限为上限为3.53.5 10108 8PaPa。固定相按。固定相按孔隙深度孔隙深度分类，可分分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相。为表面多孔型和全多孔型固定相。68v流动相流动相 （1 1）溶剂对于待测样品，

31、必须具有合适的极性）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。和良好的选择性。（2 2）溶剂与检测器匹配。）溶剂与检测器匹配。高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求：对流动相溶剂的要求：69（3 3）高纯度）高纯度 不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。（5 5）低粘度（粘度适中）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离

32、。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。（4）化学稳定性好）化学稳定性好707.7.分类分类根据分离机制不同，液相色谱可分为：根据分离机制不同，液相色谱可分为：n液固吸附色谱液固吸附色谱n分配色谱分配色谱n化合键合色谱化合键合色谱n离子交换色谱离子交换色谱n分子排阻色谱等类型。分子排阻色谱等类型。71iiiACm)(或定量依据8.8

33、.高效液相的定量方法高效液相的定量方法721.1.两种表示方法两种表示方法n绝对校正因子绝对校正因子n相对校正因子相对校正因子 相同量的同种物质对不同检测器响应不同；相同量的同种物质对不同检测器响应不同；相同量的不同种物质对同一检测器响应不同。不相同量的不同种物质对同一检测器响应不同。不可以直接用可以直接用m（或（或C）A定量。定量。73绝对校正因子（与组分性质、仪器灵敏度有绝对校正因子（与组分性质、仪器灵敏度有关）关）ifim进入检测器的物质的量或质量进入检测器的物质的量或质量SAiiiiiiACf AfC74ississiisiCACACACAfff-相对校正因子与操作条件无关相对校正因子

34、与操作条件无关f752相对校正因子的测定相对校正因子的测定过程：精称过程：精称i i纯品基准物纯品基准物ss混匀进样混匀进样测测iASAississiisiCACACACAfff761.1.系统适用性试验系统适用性试验色谱柱的理论板数（色谱柱的理论板数（n n）2212)(54.5)(16WtWtnRReff 在选定条件下，注入供试品溶液或所规定在选定条件下，注入供试品溶液或所规定的内标物，记录色谱图，按下式计算。的内标物，记录色谱图，按下式计算。v定量方法定量方法77 分离度（分离度（R R）22112WWttRRR峰宽和之半）保留值之差（峰顶间距R R应大于应大于1.51.5完全未分开完全

35、分离基本分离0.165.140.1RtRtRRR78 拖尾因子拖尾因子T=105.02dWh（T=0.951.05）重复性重复性 取各品种项下的对照溶液取各品种项下的对照溶液,连续进样连续进样5 5次次,除另有规定外除另有规定外,其峰面积测定值的相对其峰面积测定值的相对标准差应标准差应2.0%2.0%。792.2.测定法测定法（1 1）内标法加校正因子：）内标法加校正因子：方法：方法：按规定配置对照品溶液按规定配置对照品溶液CR 、内标物质溶液、内标物质溶液Cs ，注注入色谱仪，记录色谱图。测定对照品入色谱仪，记录色谱图。测定对照品的的峰面积峰面积AR和和内标物质的内标物质的峰面积峰面积As，

36、计算校正因子。，计算校正因子。取含有取含有内标物质的内标物质的供试品溶液，注入色谱仪，记录供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。测定供试品中待测组分和色谱图。测定供试品中待测组分和内标物质的内标物质的峰面峰面积（或峰高），按下式计含量。积（或峰高），按下式计含量。80对照液（对照液（R）：）：AR CR 峰面积峰面积 含量含量内标液（内标液（S）：）：AS CS供试液（供试液（X）：）：AX CXf=AS/CSAR/CRf=AS/CSAx/CxCx=f AxAS/CS818283（2）外标法）外标法方法：方法：按要求配置对照品溶液按要求配置对照品溶液CR和供试品溶液，和供试品溶液，CX分别分别进

37、样，供试品记录色谱图。测定对照品的峰面积进样，供试品记录色谱图。测定对照品的峰面积AR和供试品的峰面积和供试品的峰面积AX（或峰高）。（或峰高）。84对照液（对照液（R）：）：AR CR 供试液（供试液（X）：）：AX CXCX CRAX ARCXCR AXAR要求：进样量准确、操作条件稳定要求：进样量准确、操作条件稳定8586目的：目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求 效能指标：效能指标：评价分析方法的尺度评价分析方法的尺度 效能指标包括效能指标包括:精密度精密度,准确度准确度,检测限检测限,定量限定量限,选选择性择性,线性与范围线性与范围,

38、耐用性耐用性 第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证87 指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，表指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，表示分析方法测量的正确性。一般以回收率表示。示分析方法测量的正确性。一般以回收率表示。准确度准确度 (accuracy)(accuracy)（一）含量测定方法的准确度（一）含量测定方法的准确度 1.1.原料药：原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较加加入入量量测测得得量量回回收收率率100 882.2.制剂：

39、考察制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响其他组分和辅料对回收率的影响用含已知量被测物用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药向制剂中加入已知量的被测物向制剂中加入已知量的被测物进行测定进行测定加加入入量量本本底底量量测测得得量量回回收收率率100 与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较89例：取士的宁例：取士的宁2.5mg，精密称定加入到供试品中，精密称定加入到供试品中，按供试品溶液制备项下方法提取、测定，计算按供试品溶液制备项下方法提取、测定，计算回

40、收回收率。（率。（在已知含量的样品中在已知含量的样品中加入精密称定的对照加入精密称定的对照品品).90数据要求：数据要求：l测定测定高、中、低高、中、低三个浓度，三个浓度，n=3,n=3,共共9 9个数据来评个数据来评价回收率；价回收率；l用用UVUV和和HPLCHPLC法时，一般回收率可达法时，一般回收率可达98%98%102%102%；l容量法容量法可达可达99.7%99.7%100.3%100.3%91 在规定的测试条件下在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。定所得结果彼此符合程度。精密度精密度（一）精密度表示方法（一）精密度表示方法 1

41、.1.偏差偏差(deviation,(deviation,d d)；d d=测得值测得值-平均值平均值=X Xi-i-X X相对偏差（相对偏差（RDRD）d/X d/X 100100922100%1iXXSn（）100%100%SRSDX标准偏差平均值2.2.标准偏差（标准偏差（standard deviation,standard deviation,SDSD或或S S）3.3.相对标准偏差相对标准偏差(relative standard deviation,(relative standard deviation,RSDRSD)93容量分析、重量分析法容量分析、重量分析法 0.2%0.2%

42、紫外、原子吸收分析法紫外、原子吸收分析法 1%1%HPLCHPLC、GCGC分析法分析法 2%2%TLCTLC分析法分析法 2%2%精密度试验结果的精密度试验结果的RSD允许数值允许数值:94方法的精密度以三种形式表达方法的精密度以三种形式表达.1 1 重现性：重现性：指在不同实验室由不同分析者测定结果的精指在不同实验室由不同分析者测定结果的精密度密度.(.(药典分析方法的建立）药典分析方法的建立）2 2 中间精密度：中间精密度：指同一实验室指同一实验室,不同的时间由不同分析者或使不同的时间由不同分析者或使用不同的仪器进行测定的结果的精密度用不同的仪器进行测定的结果的精密度3 3 重复性：重复

43、性：在相同条件在相同条件,由一个分析者测定所得结果的精由一个分析者测定所得结果的精密度密度.95精密度可分为精密度可分为1.1.批内精密度（日内）：批内精密度（日内）：是同一次测得的精密度，是同一次测得的精密度，考察方法在短时期内的变异情况。考察方法在短时期内的变异情况。2.2.批间精密度（日间）：批间精密度（日间）：是不同时间、不同批次是不同时间、不同批次测得的精密度。考察分析方法在不同时间的变异测得的精密度。考察分析方法在不同时间的变异情况。情况。96 指在其他成分指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的可能存在下，采用的方

44、法能准确测定出被测物的特性。特性。鉴别、杂质检查、含量测定鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专方法，均应考察其专属性。属性。专属性专属性 97 是指试样中被测物能被检测出的是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。该规定的浓度或量即可。检测限检测限(limit of detection,LOD)(limit of detection,LOD)1.1.目视法：目视法：用含已知浓度被测物的试样进行分析，用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物

45、的最低浓度或目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，量，常用于显色鉴别法，TLCTLC法；法；2.2.信噪比法：当用信噪比法：当用GCGC和和HPLCHPLC法时，法时，一般以一般以S/NS/N2 2或或3 3时的相应浓度来确定检测限。时的相应浓度来确定检测限。98 指样品中被测物指样品中被测物能被定量测定的最低量能被定量测定的最低量。是。是在保证一定可靠性（应具有一定的准确度和精密在保证一定可靠性（应具有一定的准确度和精密度）前提下，分析方法能够测定出的样品中药物度）前提下，分析方法能够测定出的样品中药物的最低浓度。的最低浓度。确定方法确定方法:1 1 仪器分析：仪

46、器分析：S/N=10S/N=10 2 2 目视法：目视法：定量限定量限(limit of quantitation,LOQ)(limit of quantitation,LOQ)99 指利用一种方法取得精密度和准确度均符合要求指利用一种方法取得精密度和准确度均符合要求的试验结果的试验结果,而且成线性的供试物浓度的变化范围。而且成线性的供试物浓度的变化范围。线性线性回归方程的相关系数（回归方程的相关系数（r r）越接近）越接近1 1，表明线性越好，表明线性越好 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少备一系列（至少5 5份）供试液进行测定

47、，以响应值对份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出浓度作图，建立回归方程，求出r r如如UVUV：制备一个标准系列，浓度点：制备一个标准系列，浓度点n=5n=5 A=0.3-0.7 A=0.3-0.7 建立回归方程建立回归方程C=aA+b r C=aA+b r 0.99990.9999100 是指达到一定精密度、准确度和线性，测试方法是指达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限度或量的区间。适用的高低限度或量的区间。l原料药和制剂含量测定原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的：应为测试浓度的80%80%120%120%l制剂含量均匀度检查制剂含量均匀度检查：应为测试

48、浓度的：应为测试浓度的70%-70%-130%130%。l 溶出度或释放度中的溶出量测定溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的：应为限度的20%20%。范围范围101 目的：目的：为常规检验提供依据。为常规检验提供依据。是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。影响的承受程度。耐用性耐用性 (robusness(robusness典型的变动因素有：典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。数、时间等。HPLCHPLC变动因素有：变动因素有：流动相组成与流动相组成与pHpH，色谱柱，柱温，色谱柱，

49、柱温，流速等。流速等。GCGC变动因素有：变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。口和检测器温度等。102分析方法效能指标的具体应用：分析方法效能指标的具体应用：1.1.用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性2.2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性3.3.原料、制剂的含量测定及溶出度测定

50、：不要求检测限原料、制剂的含量测定及溶出度测定：不要求检测限和定量限，其余均要求。和定量限，其余均要求。103 第四节第四节 生物样品分析方法的基本要求生物样品分析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和贮藏一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证三、定量分析方法验证 104一、常用样品的种类、采集和贮藏一、常用样品的种类、采集和贮藏（一）血液（一）血液 测定药物浓度指测定测定药物浓度指测定血浆血浆或或血清血清中的药物浓度中的药物浓度 采集采集制备血浆或血清制备血浆或血清 贮藏：短期贮藏：短期44、长期、长期-20-20（二）