排阻色谱法剖析-共28页课件.ppt
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- 色谱 剖析 28 课件
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1、排阻色谱法排阻色谱法(一)定义:排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等,是液相色谱的一种。(二)分类:凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法-GFC-GFC 凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法-GPC-GPC一、简 介一般用于分离水溶性的大分子,凝胶的代表是葡萄糖系列,洗脱溶剂主要是水。主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离,常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶,洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。二、基本原理(一)分子筛效应 凝胶本身具有三维网状结构,大分子在通过这种网
2、状结构上的孔隙时被排阻,小分子通过时被滞留。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队”,凝胶表现分子筛效应。(二)排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外,叫做全排除,两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部,这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。两种排阻色谱类型比较流动相的选择必须能溶解样品,与凝胶本身非常相似,这样才能润湿凝胶。溶剂的粘度要小,因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。三、固定相与流动相固定相凝胶:一种经过交联而
3、具有立体网状结构的多聚体,含有大量液体(一般是水),柔软而富于弹性。分类:1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。2、按化学性质分为有机凝胶(均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶);无机凝胶(非均匀凝胶)。四、凝胶过滤介质常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。(一)葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是常用凝胶,由葡聚糖和交联剂甘油通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。葡聚糖凝胶的立体网状结构 由于分子内含有大量羟基而具有极性,在水和其他极性溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒,因醚键的不活泼性,故具有较高的稳定性。交联度大的孔隙小,吸液膨胀也少,可用于小分子物质的分离。交联度小的孔隙
4、大,吸液膨胀也大,适用于大分子物质的分离。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位,由甲叉双丙烯酰胺交联成的,干燥粉碎或加工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。(二)聚丙烯酰胺凝胶(三)琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件下使用(如水,pH4-9范围内的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。(四)亲脂性凝胶亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。1、聚苯乙烯凝胶:应用范围广,由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成。机械性能好,孔隙分布比较宽,多
5、应用于合成高分子材料的分离和分析。2、葡聚糖凝胶LH-20:是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基以代替羟基的氢,成醚键结合状态,因而具备了一定的亲脂性,适用于分离黄酮、色素等有机物。3、无机凝胶:无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃,机械性能好,选择性高。但其吸附性较大,处理极性大的样品需注意。凝胶特性参数(1)排阻极限(exclusion limit):指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。(2)分级范围(fractionation range):即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。%100干燥重量干燥重量)(溶胀处理平衡后重量溶胀率(3)溶胀率:某些市
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