植物叶绿素含量测定丙酮乙醇混合液法-PPT精品课件.ppt

1、 董文轩董文轩 授课教师：授课教师：齐明芳齐明芳 陈俊琴陈俊琴现代园艺实验技术现代园艺实验技术 本课程的本课程的主要目的主要目的 本课程的目的是使学生掌握园艺作物成分检测与分析本课程的目的是使学生掌握园艺作物成分检测与分析方法的基础上，侧重培养学生对现代仪器分析方法的原理方法的基础上，侧重培养学生对现代仪器分析方法的原理理解和具体应用能力。理解和具体应用能力。本课程的本课程的主要目标主要目标 通过学习现代实验技术在园艺作物上的应用理论基础，通过学习现代实验技术在园艺作物上的应用理论基础，以及系统性综合实验的操作，提高学生的实验操作技能，以及系统性综合实验的操作，提高学生的实验操作技能，同时在掌

2、握方法的基础上，增强综合运用、实验设计及观同时在掌握方法的基础上，增强综合运用、实验设计及观察分析能力，提高学生的科研兴趣及解决实际问题的综合察分析能力，提高学生的科研兴趣及解决实际问题的综合素质与能力。素质与能力。本课程主要目的和目标本课程主要目的和目标 主要内容一、园艺植物光合作用分析技术一、园艺植物光合作用分析技术二、园艺植物与土壤中痕量元素的测定原子吸收分析法三、二、园艺植物与土壤中痕量元素的测定原子吸收分析法三、园艺植物与土壤中氮磷的测定连续流动分析法差异四、园园艺植物与土壤中氮磷的测定连续流动分析法差异四、园艺植物芳香物质分析气相色谱、质谱分析技术艺植物芳香物质分析气相色谱、质谱分

3、析技术五、糖类（激素）分析技术液相色谱分析法五、糖类（激素）分析技术液相色谱分析法六、蛋白质分离纯化柱层析分析技术六、蛋白质分离纯化柱层析分析技术七、蛋白质分离鉴定双向电泳分析技术七、蛋白质分离鉴定双向电泳分析技术八、园艺植物组织切片与显微观察技术八、园艺植物组织切片与显微观察技术第一章第一章 植物光合与荧光生理指标的测定植物光合与荧光生理指标的测定（一）园艺植物（一）园艺植物光合指标光合指标的测定的测定（二）园艺植物（二）园艺植物荧光指标荧光指标的测定的测定 本章的主要内容本章的主要内容1 1、植物光合作用原理及常规测定方法、植物光合作用原理及常规测定方法2 2、LI-6400LI-6400

4、光合作用系统构成原理及测定内容光合作用系统构成原理及测定内容3 3、LI-6400LI-6400光合作用系统在测定过程中常见问题及解光合作用系统在测定过程中常见问题及解决方法决方法实验一实验一 使用使用LI-6400LI-6400光合作用系统测定园艺作物光合光合作用系统测定园艺作物光合生理指标生理指标实验二实验二 使用使用LI-6400LI-6400光合作用系统进行园艺作物光合作用系统进行园艺作物光合光合COCO2 2响应曲线的测定响应曲线的测定1 1、植物光合荧光作用原理及常规测定方法、植物光合荧光作用原理及常规测定方法2 2、LI-6400LI-6400荧光系统测定作物荧光指标的方法荧光系

5、统测定作物荧光指标的方法3 3、影响作物荧光的因素及测定中的注意事项、影响作物荧光的因素及测定中的注意事项实验三实验三 使用使用LI-6400LI-6400荧光系统测定作物光化学效率荧光系统测定作物光化学效率实验四实验四 使用使用LI-6400LI-6400荧光系统测定作物电子传递速率荧光系统测定作物电子传递速率与光化学猝灭与光化学猝灭 绿色植物吸收阳光的能量，同化绿色植物吸收阳光的能量，同化COCO2 2 和和H H2 2O O，制造有机物并释放氧的过程，称为光合作用。制造有机物并释放氧的过程，称为光合作用。光合作用所产生的有机物质主要是糖类，贮藏光合作用所产生的有机物质主要是糖类，贮藏着能

6、量。着能量。CO CO2 2+H+H2 2O O （CHCH2 2O O）+O+O2 2 可见，测定公式中任一反应物的消耗速率或可见，测定公式中任一反应物的消耗速率或产物的生成速率（包括物质的交换和能量的贮产物的生成速率（包括物质的交换和能量的贮藏）都可以用来计算净光合速率（藏）都可以用来计算净光合速率（PnPn）。）。一、光合作用测量的理论基础一、光合作用测量的理论基础净光合速率（净光合速率（PnPn）的测定方法）的测定方法（1 1）根据有机物的积累速率，主要有）根据有机物的积累速率，主要有半叶法半叶法、植物、植物生长分析法；生长分析法；（2 2）根据）根据COCO2 2 及及O O2 2

7、体积的变化，主要有微量定积体积的变化，主要有微量定积检压法；检压法；（3 3）根据）根据O O2 2 浓度的变化，主要有氧电极法；浓度的变化，主要有氧电极法；（4 4）根据）根据COCO2 2浓度的变化：酸度法、碱吸收法、浓度的变化：酸度法、碱吸收法、1414C C 标记法、红外气体分析法、微气象法。标记法、红外气体分析法、微气象法。目前，最常见的方法是目前，最常见的方法是红外气体分析法红外气体分析法。二、二、LI-6400LI-6400光合作用测量系统光合作用测量系统 LI-6400LI-6400是美国是美国LI-CORLI-COR公司的公司的第三代第三代气体交换测量系统气体交换测量系统主要

8、特点：主要特点：（1 1）开路式系统，保证了叶室内外环境条件的一致与同步变）开路式系统，保证了叶室内外环境条件的一致与同步变化，同时保证了被测量叶片的环境因子的稳定；化，同时保证了被测量叶片的环境因子的稳定；（2 2）COCO2 2/H/H2 2O O 分析器位于传感器的头部，消除了气体交换测分析器位于传感器的头部，消除了气体交换测量的时滞；量的时滞；（3 3）可自动或手动控制叶室内部的环境条件（）可自动或手动控制叶室内部的环境条件（CO2CO2浓度、光照浓度、光照强度、相对湿度、温度等），方便地进行环境条件控制下强度、相对湿度、温度等），方便地进行环境条件控制下光合速率的测定以及响应曲线的测

9、定。光合速率的测定以及响应曲线的测定。（4 4）具有多个自动测量程序，如光响应曲线、）具有多个自动测量程序，如光响应曲线、CO2 CO2 响应曲线、响应曲线、光诱导曲线、光呼吸曲线、荧光光诱导曲线、光呼吸曲线、荧光CO2 CO2 响应曲线、荧光光响响应曲线、荧光光响应曲线、荧光动力学曲线、荧光循环曲线等。应曲线、荧光动力学曲线、荧光循环曲线等。（5 5）叶室小，结构简单，操作方便。）叶室小，结构简单，操作方便。（一）硬件部分（一）硬件部分控制器电缆线电缆线IRGAIRGA（红外分析器）或叶室（红外分析器）或叶室主机主机外置光量子传感器外置光量子传感器（二）实验室配置（二）实验室配置叶叶室室配配

10、置置荧光叶室土壤叶室标准叶室附件LED红蓝光源红蓝光源CO2注入系统注入系统1、LEDLED红蓝光源红蓝光源1 1）.可以提供可以提供0 020002000molmol m m-2-2 s s-1-1之间的任意光照之间的任意光照强度强度2 2）.产热极少，基本不对测量叶片的环境条件产生影产热极少，基本不对测量叶片的环境条件产生影响。响。3 3）.LED.LED红红/蓝光源不仅提供红色光（影蓝光源不仅提供红色光（影响光合作用的最主要光照），也提供蓝响光合作用的最主要光照），也提供蓝色光（控制气孔开放的最主要光）。红色光（控制气孔开放的最主要光）。红色光的波长为色光的波长为665nm665nm，蓝

11、色光的波长为，蓝色光的波长为470nm470nm。蓝色光是研究气孔动力学的关键。蓝色光是研究气孔动力学的关键。2 2、COCO2 2注入系统注入系统1).COCO2 2浓度是通过把精确控制的纯浓度是通过把精确控制的纯COCO2 2注注入到已过滤了入到已过滤了COCO2 2的空气中来得到的。的空气中来得到的。2).可以确保高浓度可以确保高浓度CO2条件下的测量条件下的测量,生生成完整的标准成完整的标准A-Ci曲线曲线.3).在系统软件控制下在系统软件控制下,设定所需设定所需CO2浓度浓度,或者使用或者使用AutoPrograms(自动程序模式自动程序模式)自动测量一系列不同浓度的数据自动测量一系

12、列不同浓度的数据.4).可以提供可以提供8小时高达小时高达2000 mol mol-1的的CO2气体气体（三）工作原理LI-6400LI-6400是气体交换测定系统。是气体交换测定系统。光合作用与蒸腾作用的测量是光合作用与蒸腾作用的测量是基于流经叶室的气流中基于流经叶室的气流中COCO2 2和和H H2 2O O差异。差异。开放式气路系统是以气泵为动力，空气流经同开放式气路系统是以气泵为动力，空气流经同化室后排出，由于叶片光合气体中的化室后排出，由于叶片光合气体中的CO2被部分被部分吸收，吸收，用用IRGA测量进入同化室和流出同化室的空测量进入同化室和流出同化室的空气中气中CO2浓度差浓度差，

13、并按下式计算出光合速率：，并按下式计算出光合速率：Pn=FC/S 式中：式中：Pn-光合速率；光合速率；F-气体流量；气体流量；C-同化同化室进气口与出气口室进气口与出气口CO2浓度差；浓度差；S-叶片面积。叶片面积。（四）（四）LI-6400便携式光合作用仪功能便携式光合作用仪功能测测量量参参数数和和计计算算参参数数可计算光合作用指标可计算光合作用指标l表观量子效率（表观量子效率（AQY）：指：指200 mol.m-2.s-1低光强下光低光强下光光合作用最初直线方程的斜率。光合作用最初直线方程的斜率。l羧化效率（羧化效率（CE）：又称叶肉导度，是在：又称叶肉导度，是在CO2浓度低于浓度低于2

14、50 mol.m-2.s-1以下时测算出以下时测算出CO2 光合直线方程的斜率。光合直线方程的斜率。l气孔限制值（气孔限制值（Ls）：Ls1Ci/Ca l光呼吸速率光呼吸速率：2O2、340mol.mol-1 CO2低氧气体下低氧气体下的呼吸速率。的呼吸速率。lCO2利用率（利用率（CUE）：CUE（PnetTl RdarkTd）/（PgrossTl）Tl和和Td分别为光期和暗期（以小时计）分别为光期和暗期（以小时计）Pgross和和Pnet分别为粗、净分别为粗、净Pn Rdark代表暗呼吸速率代表暗呼吸速率 可进行的自动测量l 光响应曲线：根据拟合曲线得出光饱和点、光补偿点、表观量子效率等参

15、数。l CO2 响应曲线：主要研究CO2饱和点、CO2补偿点和羧化效率 l荧光CO2 响应曲线 l 荧光光响应曲线l 荧光动力学曲线l 荧光循环曲线等。三、测量中的注意事项三、测量中的注意事项 植物的光合作用和其它的生命现象一样，也经常受着外因和内因的影响而不断地发生变化。影响光合速率的外部因素有：光照、C02、温度、矿质元素、水分、氧、日变化等内部因素有种间差异、品种间差异、叶片性状、果实的存在等。因此时间的选择对测量的准确性至关重要。测定时间的选择 选择晴天无云的上午9：3011：30测定较理想。除非设计测量阴天或夜间的光合情况，以及日变化测量。注意：不同生育期一般测1-2次，天气情况要统

16、一2.选样 叶位要统一 代表性：选择最能代表叶色的植株 叶子的状态应选无病，完整，生 长健壮，向阳的功能功能叶片。包括处理的代表性，温室或露地不同栽培位置等的代表性。3.触样 尽量不要触摸所测量的叶片，更不要触摸所测部位的叶表面。4.测定时夹样品 上样时要叶面朝上轻铺到叶室中，叶片不能有折叠或褶皱。另一方面，叶片要夹在叶室的有效部分，即32cm的标准叶室内，防止叶室漏气而测量不准。5.5.数据记录数据记录 当样品室当样品室CO2CO2的浓度稳定时记录数据；也可观察的浓度稳定时记录数据；也可观察CO2CO2的值，的值，稳定时记录数据。（通常一棵健康植株叶片的稳定时记录数据。（通常一棵健康植株叶片

17、的GsGs值应在值应在0.10.11.01.0之间。超出此范围，即不正确。）之间。超出此范围，即不正确。）6.6.叶室位置叶室位置 叶室要固定，与太阳光的位置要依据是否用自带光源而叶室要固定，与太阳光的位置要依据是否用自带光源而定。当用自然光时，叶室要定。当用自然光时，叶室要垂直太阳光放置垂直太阳光放置；若用仪器自；若用仪器自带光源，叶室最好带光源，叶室最好平放平放。因为这样，外界光量子传感器的。因为这样，外界光量子传感器的位置与植物叶子在植株上长的一样，垂直向上，外界光量位置与植物叶子在植株上长的一样，垂直向上，外界光量子参数也有用。子参数也有用。7.空气缓冲气瓶空气缓冲气瓶 “Li-640

18、0光合作用测定仪光合作用测定仪”是通过测量参是通过测量参比室和样品室的气体浓度差异来测量光合速率和比室和样品室的气体浓度差异来测量光合速率和蒸腾速率的。外界空气中蒸腾速率的。外界空气中CO2浓度的自然波动浓度的自然波动(尤尤其是人为干扰比较大的情况下其是人为干扰比较大的情况下)必然造成参比室和必然造成参比室和样品室浓度的差异，需采用气体缓冲瓶来尽可能样品室浓度的差异，需采用气体缓冲瓶来尽可能降低这一波动所造成的误差。一般空气缓冲气瓶降低这一波动所造成的误差。一般空气缓冲气瓶应放在应放在远离人群、远离交通的通风之处远离人群、远离交通的通风之处。如在室。如在室内或温室做实验需更大的缓冲，但不能采取

19、把进内或温室做实验需更大的缓冲，但不能采取把进气管放在室外而机器在室内进行实验。气管放在室外而机器在室内进行实验。8.LED光源光源 LED光源即红蓝光源，是光源即红蓝光源，是“Li一一6400光合作光合作用测定仪用测定仪”的配件之一。天气晴朗时可不用的配件之一。天气晴朗时可不用LED光源，直接利用自然光测定自然状态下的光合速光源，直接利用自然光测定自然状态下的光合速率。率。LED光源虽能模拟一天的日变化，并迅速测光源虽能模拟一天的日变化，并迅速测完，但与自然条件下植物光合速率的日变化相差完，但与自然条件下植物光合速率的日变化相差很远。如果测光补偿点或在阴天或多云的日子测很远。如果测光补偿点或

20、在阴天或多云的日子测定时，定时，LED光源是不可缺少的。光源是不可缺少的。9.环境控制环境控制 环境条件控制包括流量控制、环境条件控制包括流量控制、CO2浓度控制、浓度控制、温度控制、光照控制等指标。一般情况下，流量温度控制、光照控制等指标。一般情况下，流量控制意义不大，在外界控制意义不大，在外界自然条件自然条件下测量流量为下测量流量为500mols，温室中测定流量为，温室中测定流量为300mols，并最好控制温度和光强等因子。光曲线的测定需并最好控制温度和光强等因子。光曲线的测定需要进行光照控制，要进行光照控制，CO2浓度控制对于浓度控制对于 ACI曲线的曲线的研究非常重要。一般不做温度控制

21、，除非进行温研究非常重要。一般不做温度控制，除非进行温度曲线的测量。度曲线的测量。使用中仪器常见问题使用中仪器常见问题1、如果参考室浓度（、如果参考室浓度（CO2 R _ml值）显得稳定值）显得稳定,而而样本室浓度（样本室浓度（CO2S_ml值）不稳定值）不稳定,这将提示传这将提示传感器头某处漏气。如果两室都不稳定感器头某处漏气。如果两室都不稳定,则是主机漏则是主机漏气，应检查可能发生漏气的地方。气，应检查可能发生漏气的地方。2、进行光合作用时，样本室的、进行光合作用时，样本室的CO2浓度浓度（CO2S_ml值）不变化，可能的原因：值）不变化，可能的原因：检查传感器头部的风扇是否在旋转？如是，

22、检查传感器头部的风扇是否在旋转？如是，请按照清洁光学通道的步骤清洁风扇。请按照清洁光学通道的步骤清洁风扇。3、传导（、传导（Ci）低或为负值）低或为负值 排除植物本身或所选测量叶片的生长状态不排除植物本身或所选测量叶片的生长状态不佳和外界环境（如，低温，或弱光）的因素外，佳和外界环境（如，低温，或弱光）的因素外，一可能是在水分调零时间短，以湿空气调零。解一可能是在水分调零时间短，以湿空气调零。解决的办法是，水分调零应调的时间长些，百分位决的办法是，水分调零应调的时间长些，百分位上的数波动时，才算稳定。上的数波动时，才算稳定。二可能是干燥剂使用时间太长，需更换药品。二可能是干燥剂使用时间太长，需

23、更换药品。4、如果光合作用值太高、如果光合作用值太高,Ci将太低。其主要的起将太低。其主要的起因因:IRGA匹配不良。匹配不良。5、IRGAs Not Ready信息，电源信息，电源 （1）IRGA接头未插紧接头未插紧,电缆不好电缆不好,IRGA电路板保电路板保险丝烧断。险丝烧断。（2）IRGA不起作用不起作用 如果电源接到如果电源接到IRGA,但它仍不起作用但它仍不起作用,可能是导光可能是导光轮电机停转。轮电机停转。（3）光照暗）光照暗 样本室积垢太多样本室积垢太多,光学元件积尘光学元件积尘,或者红外光源或或者红外光源或探测器失效。探测器失效。半叶法 植物进行光合作用形成有机物，而有机物的积

24、累可使叶片单位面积的干物重增加，但是，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织将同化物运出，从而使测得的干重积累值偏低。为了消除这一偏差，必须将待测叶片的一半遮黑，测量相同时间内叶片被遮黑的一侧单位面积干重的减少值，作为同化物输出量（和呼吸消耗量）的估测值。这就是经典的“半叶法”测定光合速率的基本原理。测定时须选择对称性良好、厚薄均匀一致的两组叶片，一组叶片用于测量干重的初始值，另一组（半叶遮黑的）叶片用于测定干重的终了值，不但手续烦琐，而且误差较大。氧电极法 氧电极法是一种实验室常用的测氧技术。氧电极由嵌在绝缘棒上的铂和银所构成，以氯化钾为电解质，外覆聚乙烯薄膜，两极间加0.60.8v的极化电压，溶氧可透过薄膜在阴极上还原，同时在极间产生扩散电流。此电流与溶解氧浓度成正比，电极输出的记号，可在自动记录仪上记录下来。叶片在进行光合作用时如光合速率高，则放氧量多，溶解氧也多，叶片光合作用的放氧量，可以作为测定光合速率的指标。红外气体分析法 由于 CO2对红外线有较强的吸收能力，CO2含量的微小变化即可灵敏地反映在检测仪上。红外气体分析法是根据光合过程中吸收 CO2的多少，直接计算出光合速率大小的一种测量方法，具有省时、省力、测量参数多等优点，更重要的是此法重复性好、数据稳定、准确，是目前最常用的一种方法。